高效液相色谱－电化学检测器测定富硒酵母中硒代蛋氨酸含量*

陈荣祥，保玉心

(1．遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563000；

2．贵州省遵义市理化分析测试工程技术研究中心，贵州 遵义 563000)

高效液相色谱－电化学检测器测定富硒酵母中硒代蛋氨酸含量*

陈荣祥1，2，保玉心1，2

(1．遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563000；

2．贵州省遵义市理化分析测试工程技术研究中心，贵州 遵义 563000)

目的 建立测定富硒酵母中的硒代蛋氨酸含量的高效液相色谱－电化学检测器检测法。方法 色谱柱采用Agilent Eclipse plus C18柱(150 mm×3．0 mm，3．5 μm)，流动相为100 mmol／L柠檬酸缓冲盐（pH＝2．75，含300 mg／L辛烷基磺酸钠）－甲醇（85∶15），检测电压为500 mV(ECD1)和700 mV(ECD2)。结果 硒代蛋氨酸质量浓度在1～300 μmol／L范围内与峰面积线性关系良好（r2＝0．999 6），检出限为0．30 μmol／L，加样回收率为101．30%，RSD为2．30%（n＝6）。结论 该方法操作简便，灵敏度高，重复性好，可用于富硒酵母中硒代蛋氨酸的检测。

高效液相色谱－电化学检测器；富硒酵母；硒代蛋氨酸

硒是人体重要的微量元素，具有较强的抗癌活性[1]。食物中硒的存在形式分为无机硒和有机硒，动物体对有机硒的利用率远大于无机硒[2]。富硒酵母是常见补充硒的保健产品，国内外均有大量产品在市场销售。其中硒代蛋氨酸是富硒酵母中有机硒的主要成分，占有机硒含量的65%以上[3]。目前多采用色谱分离法检测食品中硒代蛋氨酸，此方法具有高选择性和高灵敏度的优点。色谱分离方法包括气相色谱法[4－5]、液相色谱法、毛细管电泳[6－7]等。其中液相色谱法是最主要的分离方法，与其相匹配的检测方法，如液相色谱－电感耦合等离子质谱法[3，8－9]、液相色谱 －原子荧光法[10－11]、液相色谱－荧光检测法[12－13]等。其中电感耦合等离子质谱和原子荧光对硒的检测选择性较好，但这两类检测器和液相联用尚未普及，荧光检测器的灵敏度较高，但对硒代蛋氨酸的检测选择性较差。因而，电化学检测器（ECD）具有高灵敏性和低检测限，在痕量组分分析中具有明显优势。硒代蛋氨酸和蛋氨酸结构类似，都在一定条件下容易氧化，因而可以采用高灵敏、高选择性的电化学检测器进行检测。目前，国内外尚未见利用液相色谱－电化学检测器进行硒代蛋氨酸检测的报道。为此，笔者建立了快速、灵敏的高效液相色谱（HPLC）－ECD方法，用于富硒酵母中硒代蛋氨酸的测定。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Ultimate 3000型高效液相色谱（Thermo fisher），包括ISO 3100型等度泵，WPS 3000 TBSL型自动进样器，CoulochemⅢ型电化学检测器（含6011串联双电极检测池），工作站为Chromeleon 6．8；PE－50型pH计（Mettler Toledo）；AL104型电子天平（万分之一，Mettler toledo）；Elix超纯水仪（Merck Millipore）。

1．2 试药

富硒酵母粉(市售，批号为201505)；富硒酵母片(市售，批号为 435568)；普通酵母粉(市售，批号为20150227)；硒代蛋氨酸(含量为97%，批号为L530N44，北京百灵威科技有限公司)；Tris(分析纯)、脂肪酶(批号为45212)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色谱纯)、柠檬酸(ACS级)、柠檬酸钠(ACS级)、辛烷基磺酸钠(ACS级)、链霉蛋白酶(批号为SLB5636V)均购自Sigma－Aldrich公司；实验室自制超纯水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：AgilentEclipse plus C18柱（150 mm×3．0 mm，3．5 μm）；柱温：35℃；流动相：100 mmol／L柠檬酸缓冲盐（pH＝2．75，含 300 mg／L辛烷基磺酸钠）－甲醇溶液（85∶15）；流速：0．4 mL／min；进样量：5 μL；自动进样器温度：4℃；检测池电压：500 mV（ECD1）和700 mV（ECD2）。

2．2 溶液制备

对照品溶液：准确称取硒代蛋氨酸标准品，用0．1 mol／L盐酸溶解、定容并摇匀后，配制成10mmol／L的标准贮备液，保存于－20℃的冰箱中。使用前将标准贮备液用流动相稀释，配制成一系列不同浓度的对照品溶液。

供试品溶液[14]：准确称取0．5 g富硒酵母粉或粉碎后的富硒酵母片，加入30 mmol／L pH 7．5的tris－HCl缓冲溶液5 mL（含 20 mg链霉蛋白酶和10 mg脂肪酶），37℃下震荡20 h。2 500 r／min离心10 min，上清液经0．22 μm滤膜过滤，即得。阴性对照品溶液：取普通酵母粉，按供试品溶液制备方法处理，即得。

2．3 方法学考察

专属性试验:按拟订色谱条件，取硒代蛋氨酸对照品溶液、富硒酵母酶解液及普通酵母酶解液各5 μL进样。结果硒代蛋氨酸对照品溶液与供试品溶液色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照品溶液在此无对应色谱峰。色谱图见图1。

线性关系考察：将硒代蛋氨酸标准贮备液用流动相逐级稀释为浓度为 1．0，5．0，10．0，50．0，100．0，300．0 μmol／L的标准工作液，每个浓度的标准溶液平行进样3次，以峰面积(Y，nA·min）为纵坐标、样品浓度(X，μmol／L）为横坐标绘制标准曲线。硒代蛋氨酸的回归方程为 Y＝5．191 0 X＋0．247 5，r2＝0．999 6(n＝6)。结果表明，硒代蛋氨酸浓度在1～300 μmol／L范围内与峰面积呈良好的线性关系。以信噪比（S／N）＝3计算本方法的检出限为0．30 μmol／L。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样 5次，记录峰面积。结果的 RSD为0．94%(n＝5)，表明仪器精密度良好。

图1 专属性试验色谱图

稳定性试验：硒代蛋氨酸可在直流氧化模式下测定，说明具有较强的还原性，因此在自然条件下也有可能会被氧化。为了研究样品稳定性对研究结果的影响，本研究中将自动进样器温度设置为4℃，采用同一份(浓度为50 μmol／L标准溶液)样品重复进样，得到峰面积随时间的变化规律。结果的 RSD小于2．00%，表明供试品溶液于4℃下在24 h内稳定性良好。

重复性试验：精密称取同一批样品，按2．2项下方法制备供试品溶液5份，分别进样测定含量。结果硒代蛋氨酸含量为92．97 μg／g，RSD为2．1%(n＝5)，表明该方法重复性良好。

加样回收试验：在已知硒代蛋氨酸含量的样品中进行回收率试验，3个添加水平分别为 30．0，50．0，100．0 μmol／L，用优化后的处理方法对硒代蛋氨酸进行含量测定，每个浓度平行进样6次，计算回收率。结果见表1。

2．4 样品含量测定

按本方法对富硒酵母粉和富硒酵母片分别进行测定，结果二者硒代蛋氨酸的平均含量分别为1 206．56 μg／g和92．97 μg／g(n＝3)。

表1 硒代蛋氨酸加样回收试验结果（n＝6）

3 讨论

3．1 流动相选择

和其他的检测器有所不同，使用电化学检测器时流动相中需要有一定浓度的缓冲盐。因而通常可以调节流动相的pH来改变结构中含有酸碱基团化合物的保留时间。酵母酶解液中氨基酸的含量丰富，其中不乏在电化学检测器中有响应的氨基酸成分，如酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸等。通过优化流动相条件，可以将富硒酵母酶解液中的硒代蛋氨酸和干扰组分分离。

由于氨基酸在反相C18柱中保留能力较弱，因此加入了一定浓度的辛烷基磺酸钠来增加色谱柱的分离能力。通过在调节pH，0～600 mg／L范围内调节辛烷基磺酸钠的浓度，最终确定流动相为100 mmol／L柠檬酸缓冲盐（pH＝2．75，含300 mg／L辛烷基磺酸钠－甲醇（85∶15）溶液。

3．2 检测电压选择

在优化的流动相条件下，将检测池的电压由0 mV逐渐升高至800 mV，同一份样品重复进样，可见峰高随电压的变化而变化，提示在电压低于500 mV时，硒代蛋氨酸几乎不氧化，而700 mV时氧化完全。故试验中将ECD1的检测电压设为500 mV，用于氧化样品中的部分，干扰组分，以降低噪音；将ECD2的电压设为700 mV，用于硒代蛋氨酸的检测。

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Determination of Selenomethionine in Selenium－Enriched Yeast by HPLC－Electrochemical Detector

Chen Rongxiang1,2,Bao Yuxin1,2
(1．Center for Medical and Biological Research,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou,China 563000;
2．Zunyi Municipal Center for Physical and Chemical Analysis and Testing Technology,Zunyi,Guizhou,China 563000)

Objective To establish an HPLC－electrochemical detection method for the determination of selenomethionine in seleniumenriched yeast．M ethods The column was an Agilent Eclipse plus C18column(150 mm×3．0 mm,3．5 μm)．100 mmol／L citrate buffer (pH＝2．75,containing 300 mg／L1－Octanesulfonic acid sodium salt)－methanol(85∶15)was used as the mobile phase and the detection voltage was set at 500 mV(ECD1)and 700 mV(ECD2)．Results Selenomethionine showed good linearity in the range of 1－300 μmol／L(r2＝0．999 6),the detection limit was 0．30 μmol／L,and the recovery rate was 101．30%,RSD was 2．30%(n＝6)．Conclusion The method is simple,sensitive,reproducible,which can be used for the determination of selenomethionine in seleniumenriched yeast．

HPLC－electrochemical detector;selenium－enriched yeas;selenomethionine

R927．2；R977．4

A

1006－4931(2016)23－0068－03

陈荣祥(1984－)，男，博士研究生，讲师，研究方向为色谱分析，(电子信箱)chenrongxiang2014＠163．com；保玉心(1979－)，女，硕士研究生，副教授，研究方向为色谱分析，本文通讯作者，(电子信箱) baoyuxinzmc＠163．com。

2016－08－01)

*遵义医学院博士启动基金，项目编号：F－798；贵州省科技厅基础研究项目，项目编号：黔科合基础〔2016〕1172。