反硝化聚磷菌生物特性的研究

张 爽,刘春花,李向红,张建平

(1.黑龙江工程学院 土木与建筑工程学院，黑龙江 哈尔滨 150050；2.黑龙江大学，黑龙江 哈尔滨 150080；3.哈尔滨供排水集团，黑龙江 哈尔滨 150040；4. 黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江 哈尔滨 150028)

反硝化聚磷菌生物特性的研究

张 爽1,刘春花2,李向红3,张建平4

(1.黑龙江工程学院 土木与建筑工程学院，黑龙江 哈尔滨 150050；2.黑龙江大学，黑龙江 哈尔滨 150080；3.哈尔滨供排水集团，黑龙江 哈尔滨 150040；4. 黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江 哈尔滨 150028)

采用平板划线法对反硝化聚磷菌进行分离、纯化，并富集培养，选定脱氮除磷效果最佳的菌株12为试验反硝化聚磷菌菌株。观察菌群的表观性质，研究不同碳源、氮源、温度、pH值对反硝化除磷菌生长特性及除磷效果的影响，为污水同步脱氮除磷工艺改革与创新提供新的思路与视角。

反硝化聚磷菌；平板划线法；生物特性；分光光度法

1 概 述

随着越来越多的国家和地区对氮磷排放标准要求的日益提高，研究和开发经济高效的污水脱氮除磷技术成为污水处理工程领域的研究重点，各种同步脱氮除磷工艺应运而生。然而，传统的生物脱氮除磷组合工艺存在菌群难以协调的矛盾和竞争，诸如污泥龄、硝酸盐、温度以及pH等方面的问题，影响工艺的处理效率，难以同时实现高效脱氮除磷。可见传统的脱氮除磷工艺中存在着自身难以解决的弊端，因而研究新的生物脱氮除磷方法十分重要。反硝化除磷理论的发现与深入研究为污水同步脱氮除磷工艺改革与创新提供了新的思路与视角，由此成为近年来水处理研究领域的一个热点。

2 反硝化聚磷菌的生物特性

2.1 实验内容

实验研究主要通过批式实验的形式完成，试验思路为纯种培养方式试验方法，本次试验接种的污泥为污水处理厂反应池曝气末端取混合液，从中分离、筛选及富集出反硝化聚磷菌，观察磷细菌的表观性质，研究不同碳源、氮源、温度、pH值对反硝化除磷菌生长特性及除磷效果的影响。

2.2 试验培养基

1)富集培养基：CH3COONa·3H2O 3.32 mg、K2HPO425 mg、NH4Cl 305 g、KNO3300 mg、MgSO4·7H2O 90 mg、CaCl·2H2O 25 mg、CaCl·2H2O 25 mg、NaCl 10 mg、微量元素2 ml、PIPES缓冲剂8.5 g、蒸馏水1 L、pH7.0～7.2。

2)牛蛋白胨培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L、pH7.0～7.2。

3)无机盐培养基：葡萄糖1.0 g、NaCl 0.5 g、NH4NO31.0 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、蒸馏水1 L 、pH7.0～7.5。

4)LB培养基：酵母浸粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 L、pH7.0～7.2。

2.3 检测指标

1)菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》和《一般细菌常用鉴定方法》进行。

表1 缺氧培养试验

2)测定上清液磷浓度采用钼锑抗分光光度法。

3)测定硝酸盐氮浓度采用紫外分光光度法。

4)测定细菌的生长量采用分光光度计测定。

细菌的生长量采用722型可见分光光度计测定，以波长λ=600 nm处的吸光度表示，培养后菌液用已灭菌的双蒸水洗涤，并悬浮于等量双蒸水中测定OD600 nm。

2.4 试验方法及分析

2.4.1 碳源的影响

碳元素同样是菌株生长必需的元素之一，既用于细胞物质的组成，还常常作为细胞的能源。

在6个250 mL锥形瓶中各加入100 mL无机盐培养基，将菌株12按1%的接种量接种，5个瓶中分别加入1.0 g不同碳源，碳源依次为蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖。置于恒温振荡器(180 r·min-1、30 ℃)中培养12 h，测定OD600 nm。设接种但不加碳源的参比，如果菌液明显大于参比，就认为该碳源可利用。不同碳源对菌株12生长的影响结果如图1所示。菌株12对葡萄糖和麦芽糖的利用率最高，OD600 nm分别达到1.35和1.19。

图1 菌株12在不同碳源条件下的生长吸光度值

2.4.2 氮源的影响

氮元素同样是菌株生长必需的元素之一，是菌株中蛋白质、核酸和辅酶的重要组成成分。

在5个250 mL锥形瓶中各加入100 mL无机盐培养基，将菌株12按1%的接种量接种，以葡萄糖为碳源，5个瓶中分别加入1.0 g不同氮源，包括蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、NH4Cl、NH4NO3，置于恒温振荡器(180 r·min-1、30 ℃)中，培养12 h，测定OD600 nm。不同氮源对菌株12生长的影响结果如图2所示。在供试的几种氮源中，菌株12对酵母膏和蛋白胨两种有机氮源利用率最高，对无机氮源NH4Cl的利用率也较高。

图2 菌株12在不同氮源条件下的生长吸光度值

2.4.3 温度的影响

污水生物处理的核心是微生物的代谢，而代谢是各种酶促反应实现的。由于生物蛋白的活性受温度影响较大，酶具有蛋白质特性，所以在污水生物处理中需要在合适的温度下进行，才有利于提高污水处理效果。

将菌株12按1%的接种量接种装有100 mL LB培养基的250 mL锥形瓶中，置于恒温振荡器(180 r·min-1)中，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃条件下各培养12 h，测定OD600 nm。由图3可知，菌株12于LB培养基中在25～35 ℃时生长最好，生长量最大，最适宜生长温度是30 ℃，说明菌株12属于中温型的细菌。当温度超过40 ℃时，在LB培养基中菌株12生长受到明显抑制。

图3 菌株12在不同温度条件下的生长吸光度值

菌株12属于中温菌株，其适宜的温度与室温较接近，在室温条件下就能较好地完成脱氮除磷作用，在实际工程中更利于节约成本。

2.4.4 pH值的影响

不同的微生物对pH适应能力都不同，即它们生长的pH范围有宽有窄，所以在反硝化细菌生长过程中， 环境的pH是一个非常重要的指标。 在适

宜的pH范围内，菌株的生长代谢酶的活性较高，从而生长速率也较快。当低于或高于这个范围，可能会使酶的活性降低，甚至丧失，从而影响污水处理效果。

在6个250 mL锥形瓶中各加入100 mL配好的LB液体培养基，将菌株12按1%的接种量接种，pH值分别调为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0，置于恒温振荡器(180 r·min-1，30 ℃)中培养12 h，测定OD600 nm。

由图4可知，菌株12的生长对pH没有特殊要求。在LB培养基中菌株12生长的最适宜pH为7.0。在pH低于7.0的酸性条件下，菌株12的生长受到明显的抑制，在pH达到5.0时，菌株12几乎不生长；而pH高于7.0的碱性条件则对菌株12生长的抑制要小得多。

图4 菌株12在不同pH条件下的生长吸光度值

3 结束语

反硝化聚磷菌株12在碳源上对葡萄糖和麦芽糖的利用率最高，在氮源上对酵母膏和蛋白胨两种有机氮源利用率最高；菌株12最适宜生长温度是30 ℃，最适宜pH为7.0。

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[责任编辑：郝丽英]

Research on biological characteristics of denitrification phosphorus removal bacteria

ZHANG Shuang1, LIU Chunhua2,LI Xianghong3,ZHANG Jianping4

(1.College of Civil and Architectural Engineering,Heilongjiang Institute of Technology，Harbin 150050,China；2.Heilongjiang University，Harbin 150080,China；3.Harbin Water Supply and Drainage Group，Harbin 150040,China；4. Heilongjiang Institute of Quality Inspection，Harbin 150028,China)

The denitrification phosphorus removal bacteria are separated and purified with the plate streak method, and the best strain 12 are selected for the experiment. By studying the flora of the apparent properties of different carbon and nitrogen sources, temperature, pH value and growth characteristics of phosphorus removal effect on denitrifying phosphorus removal bacteria, this paper provides the new ideas and perspectives for the simultaneous removal of nitrogen and phosphorus removal of sewage reform and innovation.

denitrification phosphorus removal bacteria; plate streak method; biological characteristics; spectrophotometric method

10.19352/j.cnki.issn1671-4679.2016.06.009

2016-09-05

黑龙江省教育厅科研项目资助(12541680)

张 爽(1972-),女,副教授,研究方向：污水水质处理.

Q93-3

A

1671-4679(2016)06-0038-03