糖肾方对糖尿病肾病大鼠血液流变学及内皮细胞功能的影响*

杜月光， 顾晶晶， 柴可夫

(浙江中医药大学 1病理教研室, 2中医临床基础研究所， 浙江 杭州 310053)



糖肾方对糖尿病肾病大鼠血液流变学及内皮细胞功能的影响*

杜月光1， 顾晶晶1， 柴可夫2△

(浙江中医药大学1病理教研室,2中医临床基础研究所， 浙江 杭州 310053)

目的： 观察糖肾方对糖尿病肾病(DN)大鼠血液流变学及内皮功能的影响。方法:采用高脂高糖饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导建立2型糖尿病合并DN大鼠模型，将建模成功大鼠随机分为DN模型组、糖肾方组和缬沙坦组，同时设正常对照组。药物干预12周后，全自动生化分析仪检测大鼠空腹血糖(FBG)、血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平；微循环血流仪检测肾微循环变化；血液流变仪检测血液流变学指标；ELISA技术检测尿白蛋白以及血清假血友病因子(vWF)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)含量。结果:与正常对照组比较，DN模型组大鼠FBG、血清TC、TG和尿白蛋白明显升高(P<0.05)，血清vWF浓度升高(P<0.01)；与DN模型组比较，糖肾方组和缬沙坦组的FBG差异无统计学显著性，血清TC、TG和尿白蛋白明显降低(P<0.05)，vWF降低(P<0.01)。与正常对照组比较，DN模型组的血浆黏度,卡松黏度,全血高切、中切黏度，红细胞聚集指数,刚性指数及电泳时间均显著升高，红细胞变形指数降低(P<0.01)。与DN模型组比较，治疗组的血浆黏度,卡松黏度,全血高切、中切和低切黏度，红细胞聚集指数,刚性指数及电泳时间均明显降低(P<0.01)，红细胞变形指数升高，但无显著性差异。与正常对照组比较，DN模型组的肾皮质微循环血流量减少(P<0.01)。与DN模型组比较，糖肾方组的肾皮质微循环明显增加(P<0.05)，缬沙坦组无明显改变。结论:糖肾方能降低实验性DN大鼠的血脂水平，改善血液流变性和内皮功能，从而改善微循环，对糖尿病肾脏具有一定的保护作用。

糖尿病肾病； 糖肾方； 微循环； 内皮功能； 血液流变学

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见和严重的微血管并发症之一，主要是由糖尿病糖脂代谢紊乱引起的以肾小球血管损伤为主的病变，最终引起肾小球和肾功能衰竭，是终末性肾病的主要原因。目前，DN确切的发病机制至今尚未完全阐明，近年来，许多文献报道，糖尿病肾病患者存在着血液流变学显著异常及内皮细胞损伤[1-2]。血液流变学异常及血管内皮细胞损伤已成为糖尿病肾病发生和发展的重要机制[3]。因此，及时有效地改善血液流变学和保护内皮细胞的功能，对防治糖尿病血管并发症的发生具有重要的意义。糖肾方(Tangshen formula,TS)是柴可夫等[4]根据DN气阴两虚兼有血瘀的病机而拟定的益气养阴、活血通络的经验方，具有益气养阴、活血化淤功效，临床治疗消渴日久、气阴不足、淤血痰浊之糖尿病肾病，效果明显；前期多次实验表明糖肾方对糖尿病肾脏有保护作用，其机制包括降低血脂、抗自由基抑制炎症等多个方面，提示其作用的多靶点、多方位[5-6]。为了进一步证实该方的疗效，阐明其作用机制，本研究从血液流变学、内皮细胞功能及肾脏微循环的角度探讨糖肾方对早期DN大鼠的保护作用机制，为其临床应用提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，清洁级，体质量为(180±20)g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号为SCXK(沪)：2008-0016。饲养于浙江中医药大学实验动物研究中心，SYXK许可证号为(浙)2013-0184，室温18～22 ℃，相对湿度40%～70%，通风良好，大鼠自由摄食、饮水，12 h交替照明。

1.2 药物 糖肾方由黄芪、葛根、灵芝、女贞子、大黄、丹参6味中药组成，购自浙江中医药大学门诊部，由浙江省中医院药剂室煎制为含生药2 g/mL的浓缩液，4℃冰箱保存。缬沙坦(valsatan)胶囊，由北京诺华制药有限公司生产，每粒80 mg。

1.3 试剂和主要仪器 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自Sigma。血清假血友病因子(von Willebrand’s factor，vWF)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)ELISA 试剂盒购自上海森雄生物有限公司。7020型全自动生化分析仪为HITACHI产品；激光多普勒微循环血流仪为Moor产品；全自动血液流变仪(型号FASCO-3020B)为重庆大学维多生物公司产品。

2 方法

2.1 动物模型的复制 大鼠适应性饲养1周后，在文献[7]的基础上略作修改，进行动物模型复制：采用高脂高糖饲料(10%蛋黄粉、10%猪油、10%蔗糖和0.5%胆固醇，其余为基础饲料)喂养联合STZ 30 mg/kg尾静脉注射造模，STZ注射后72 h后，尾尖采血检测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，以FBG≥11.2 mmol/L为2型糖尿病模型。继续高脂高糖喂养，每隔2周尾静脉采血检测随机血糖，留取24 h尿液，记录尿量并检测尿白蛋白(urine albumin, U-alb)，当血糖持续≥16.7 mmol/L及24 h尿白蛋白排泄率与正常大鼠有显著差异确定为DN模型。

2.2 动物分组与给药 将DN成模大鼠随机分为DN模型组、糖肾方组和缬沙坦组，同时设正常对照组(normal组)。糖肾方组大鼠予以糖肾方13 g·kg-1·d-1(为成人日用量的10倍)；缬沙坦组大鼠给予缬沙坦25 mg·kg-1·d-1(缬沙坦为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，对糖尿病肾脏有保护作用，因此作为西药对照)；正常对照组和DN模型组大鼠每日给予蒸馏水4 mL。各组大鼠每天灌胃1次，连续12周。

2.3 检测指标与方法 实验结束前 1 天，使用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，用于测定尿微量白蛋白指标。大鼠禁食不禁水10 h，称取体重。用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，从腹中线打开腹腔，暴露两侧肾脏，用激光多普勒血流仪测定大鼠肾皮质微循环血流量；心脏取血4.5 mL，一部分置于含肝素的抗凝管中，混匀，用于测定血液流变学指标：血浆黏度、卡松黏度、全血黏度、红细胞变形指数、聚集指数、刚性指数和电泳时间；一部分用于分离血清，检测FBG、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)及vWF和PAI-1的浓度。FBG、TC和TG采用全自动生化分析仪检测；U-alb、vWF和PAI-1的浓度采用ELISA 技术，严格按照说明书步骤进行。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析，对各组均数间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。

结 果

1 各组血糖、血脂及肾功能的比较

表1结果显示，与正常对照组比较，DN模型组的FBG、血清TC和TG明显升高(P<0.01)，U-alb增加(P<0.05)。与DN模型组比较，糖肾方组的TC和TG显著下降，U-alb降低(P<0.05)，FBG有一定程度的降低，但差异无统计学显著性；缬沙坦组的TC、TG和U-alb排泄率显著下降(P<0.05)，FBG下降不明显。糖肾方组和缬沙坦组两组之间差异无统计学显著性。

表1 各组大鼠生化指标的变化

2 各组大鼠血液黏滞性的比较

表2结果显示，与正常对照组比较，DN模型组血浆黏度、卡松黏度及全血高、中切黏度均显著升高(P<0.01)，低切黏度有一定程度的升高，但差异无统计学显著性；与DN模型组比较，糖肾方组和缬沙坦组血液黏滞性各指标明显降低(P<0.01)；糖肾方组和缬沙坦组两组之间差异无统计学显著性。

3 各组大鼠红细胞流变性的比较

与正常对照组比较，DN模型组红细胞刚性指数及电泳时间均显著增高，变形指数降低(P<0.01)，红细胞聚集指数有一定程度的增高，但差异无统计学显著性；与DN模型组比较，糖肾方组和缬沙坦组红细胞聚集指数、刚性指数和电泳时间显著降低(P<0.01)，变形指数的差异无统计学显著性；糖肾方组和缬沙坦组两组之间差异无统计学显著性，见表2。

表2 各组大鼠血液流变学指标的变化

4 各组大鼠vWF和PAI-1的比较

与正常对照组相比，模型组大鼠vWF明显增高(P<0.01)，PAI-1有一定程度的增高，但差异无统计学显著性；与DN模型组相比，糖肾方组和缬沙坦组vWF均明显降低(P<0.01)，PAI均有一定程度的降低，但差异无统计学显著性。糖肾方组和缬沙坦组两组之间差异无统计学显著性,见表3。

5 各组大鼠肾脏皮质微循环血流量的比较

表3结果显示，与正常对照组比较，DN模型组肾脏皮质微循环血流量显著降低(P<0.01)；与DN模型组比较，糖肾方组明显增加肾脏皮质血流(P<0.05)，缬沙坦组肾脏皮质微循环血流增加不明显。

表3 各组大鼠血清vWF、PAI-1的浓度和肾皮质血流的变化

Table 3.The changes of the content of vWF and PAI-1 and renal cortex blood flow in the rats with different treatments(Mean±SD.n=6)

**P<0.01 vs normal group; △P<0.05, △△P<0.01 vs DN group.

讨 论

糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症，也是终末期肾病的主要原因。DN的发生是多因素共同参与、相互作用的结果。血液流变学异常及血管内皮细胞损伤已成为糖尿病肾病发生和发展的重要机制[3]。本实验结果显示，造模12周后，DN大鼠尿白蛋白增加，FBG、TC和TG水平增高，血黏粘度、卡松黏度和全血黏度升高，红细胞聚集性和刚性增强，变形能力降低，红细胞电泳时间延长，提示DN大鼠有肾功能障碍以及高血脂和血液黏滞度的异常，与临床特点一致。vWF被认为是内皮细胞损伤及功能障碍的标志物，并且是糖尿病微血管病变的独立危险因子，其水平随着 DN 的严重程度而增加[8-9]。此外内皮功能异常还表现为PAI-1 活性增高导致纤溶活性降低，PAI-1的升高可促进糖尿病肾纤维化的进展[10-11]。本实验结果显示DN大鼠血清中vWF和PAI-1含量增加，但PAI-1含量无差异显著性；大鼠肾脏皮质微循环血流量显著降低，提示DN大鼠存在血管内皮细胞损伤及肾微循环的异常。

糖尿病属中医学“消渴”范畴，糖尿病肾病是消渴日久，治不得法，伤阴耗气，再加以瘀、痰、湿等相互积聚于肾之络脉，逐步使肾体受损，肾用失司所致[12]，故予补益肾阴、活血通络方剂治疗该病，可达标本兼顾之功效。糖肾方由黄芪、葛根、灵芝、女贞子、大黄、丹参6味中药组成。葛根解热生津为君药，黄芪善益气扶正，二药合用具益气生津之功，灵芝能益肝心脾肺肾之气，女贞子滋肾水，补肝阴，清虚热，酒制大黄活血化瘀之力强，与丹参合用推动血行，清除体内痰浊瘀血，故诸药配伍能直中病机，调畅全身气血运行，使脉络得养。

前期研究结果显示糖肾方对糖尿病肾脏有保护作用，其机制包括降低血脂，抗自由基，以及通过抑制炎症等多个方面[5-6]。为进一步阐明其机制，本项目观察糖肾方对血液流变学的影响及内皮细胞的保护作用。本实验研究结果显示，与模型组比较，糖肾方治疗组U-alb 排泄降低，提示糖肾方具有保护肾脏的作用，这与以往的研究一致[5]。同时本研究结果还显示，糖肾方干预可使血脂、血浆黏度、卡松黏度、全血黏度等指标降低，还可降低红细胞聚集指数、刚性指数和电泳时间，可降低vWF和PAI-1含量，有效提高DN大鼠肾脏皮质血流量，提示糖肾方对于改善DN血液流变学指标以及内皮细胞功能有较好的效果。现代中医研究认为[13]血流变、血脂等指标的变化可反映糖尿病肾病模型中瘀血阻络证候的存在，并且糖尿病肾病瘀毒阻滞肾络与炎症发病学说之间具有一定的相关性[14]。由此我们推测，糖肾方对糖尿病肾脏的保护作用可能通过改善血液流变学和内皮细胞的功能，从而改善肾微循环实现的，与中医的治则“益气养阴，活血通络”相一致。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Influence of Tangshen formula on endothelial function and hemorheology in diabetic nephropathy rats

DU Yue-guang1, GU Jing-jing1, CHAI Ke-fu2

(1PathologyDepartment,2NationalTCMClinicalResearchCenter,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China.E-mail:ckf666@163.com)

AIM: To explore the influence of Tangshen formula (TS) on endothelial function and blood rheology in diabetic nephropathy (DN) rats. METHODS: The DN rat model was established by intravenous injection of low-dose (30 mg/kg) streptozotocin (STZ) after having the high-fat/high-glucose diets for one month. The animals were divi-ded into DN model group, TS group and valsartan group. Fasting blood glucose (FBG), serum total cholesterol (TC), serum triglyceride (TG), renal cortex blood flow and hemorheology were monitored. The content of von Willebrand’s factor (vWF) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in the serum was determined by ELISA. RESULTS: Compared with normal group, FBG,TC,TG, vWF and PAI-1 were increased in DN model group (P<0.01). Compared with DN model group, TC, TG, vWF and PAI-1 were decreased in TS group and valsartan group (P<0.05), and no significant difference of FBG was observed. Compared with normal group, plasma viscosity, Casson viscosity, whole blood high/medium/low-shear viscosity, erythrocyte aggregation index, erythrocyte rigidity index and erythrocyte electrophoresis time were increased, and erythrocyte deformation index was decreased in DN model group (P<0.01). Compared with DN model group, plasma viscosity, Casson viscosity, whole blood high/medium/low-shear viscosity, erythrocyte aggregation index, erythrocyte rigidity index and erythrocyte electrophoresis time were decreased (P<0.05), but there was no significant difference for erythrocyte deformation index in TS group. Compared with normal group, the renal cortex microcirculation blood flow in DN model group was significantly decreased. Compared with DN model group, the renal cortex microcirculation blood flow was significantly increased in TS group (P<0.05), and no significant change in valsartan group was found. CONCLUSION: Tangshen formula plays a protective role in the kidney of diabetic rats by improving the blood rheology and endothelial function, thus ameliorating the renal cortex microcirculation blood flow in experimental diabetic rats.

Diabetic nephropathy; Tangshen formula; Microcirculation; Endothelial function; Hemorheology

1000- 4718(2016)11- 2079- 04

2016- 06- 08

2016- 09- 01

国家自然科学基金资助项目(No. 81273615)

R285; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.027

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 13588111461； E-mail: ckf666@163.com