自发性高血压大鼠心肌组织microRNA-97a与TGF-β 1蛋白表达的改变及意义

郑 婧

(贵州医科大学附属医院，贵阳 550001)



研究报告

自发性高血压大鼠心肌组织microRNA-97a与TGF-β 1蛋白表达的改变及意义

郑 婧

(贵州医科大学附属医院，贵阳 550001)

目的观察 Micro RNA-97a(miRNA-97a)与TGF-β 1蛋白在自发性高血压大鼠(SHR)心肌组织中的表达改变和关系。方法取8只8周龄雄性自发性高血压大鼠为 SHR 组，8只8周龄雄性 Wistar大鼠为对照组，通过无创血压测量分析系统测大鼠尾动脉血压，8 周后股动脉放血处死大鼠，HE染色观察大鼠心脏形态学改变,PCR法检测大鼠心脏中miRNA-97a的表达，Western blot 检测TGF-β1、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)蛋白和I 型胶原(Col-Ⅰ)和Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)蛋白的表达水平。结果SHR组的收缩压和舒张压明显升高，心肌CVF 和 PVCA 明显升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表达水平明显升高，miRNA-97a表达水平明显降低，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0. 01)。PCR结果显示，SHR 组心肌 miRNA-97a 表达水平为对照组的(24. 6 ±4. 7)%，SHR 组心肌组织miRNA-97a与TGF-β 1 蛋白表达水平呈负相关(r=-0. 785，P<0. 01)。结论SHR心肌组织 miRNA-97a表达下调，伴随 TGF-β 1 蛋白表达升高和胶原合成增加。miRNA-97a 与TGF-β 1 可能参与 SHR 大鼠的心肌纤维化。

Micro RNA-97a; 转化生长因子β 1; 自发性高血压大鼠; 心肌纤维化

高血压，冠心病等疾病在心内科最常见[1-2]。这两年有报道，微小核糖核酸(microRNA)可以通过对基因转录后控制基因表达调控方式[3]。也有研究说明miRNA参与心肌纤维化和动脉硬化等病理过程[4]。最近一段时间，有不少的医务工作者称microRNA的重要成员之一miRNA-97a与心肌重构关系密切，很有可能成为高血压、冠心病等疾病的一个新的治疗靶点[5-6]。目前为止，我们对于miRNA-97a在心血管重构中的作用及机制没有完全清楚。本次研究探讨了SHR大鼠心肌组织microRNA-97a与TGF-β1蛋白表达的改变及意义。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

表1 试剂和仪器Tab.1 Reagent and instrument

1.2 实验动物及血压测定

8周龄雄性 SHR16 只和Wistar 大鼠8只，均购自中山大学动物实验中心【SCXK(粤) 2011-0034】，体质量230 ± 15 g，所有大鼠均在贵州医科大学附属医院动物实验室【SYXK(黔) 2012-0001】的清洁环境下饲养观察。将SHR大鼠随机分为 SHR 卡托普利组(SHR 干预组，n=8)、SHR 对照组(n=8)，Wistar大鼠为正常对照组;分别给予SHR大鼠卡托普利(中美上海施贵宝制药有限公司)10 mg/(kg·d)和蒸馏水灌服，共持续8周。成功制作SHR干预组和SHR对照组大鼠模型。

1.3 大鼠心肌组织 Masson 染色和SP法观察TGF-β 1 蛋白表达

采用免疫组织化学SP法，取出盖玻片上用于免疫组化的大鼠心肌组织，0.01molPL PBS 漂洗2 次,并予4% 甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，并行脱蜡、水化, 对部分切片进行PBS冲洗并加聚合物增强剂和大鼠抗人 TGF-β1多克隆抗体等试剂,在室温下孵化,最后加入DAB显色液, 用苏木素复染色,并用中性树脂封片。封片完毕后将切片放置显微镜下观察 TGF-β1在两组大鼠心肌细胞中的表达情况, 阳性显色为棕黄色。另一部分石蜡切片常规脱蜡后行Masson 胶原染色。每张切片任选 3 支小动脉，测量血管周围胶原面积比率(PVCA )。

1. 4 Western Blot 检测 TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ 蛋白表达水平

提取大鼠心脏组织的总蛋白，在100℃加热 10 min 以使蛋白质变性。电泳，蛋白转移至 PVDF 膜，5% 的脱脂奶粉封闭 2 h，加入TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等一抗，4℃孵育过夜，选择TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等酶标二抗和稀释浓度，孵育 1 h，洗膜后化学发光，拍照，分析显影条带。

1.5 Real-time PCR 检测miRNA-97a表达水平

根据其mRNA 序列,设计引物。miRNA-97a引物:上游:5′ -TAC CCT ACT ACC AAT ATT-3′;下游:5′ -CCT TTC CAT CTT CCT TCG ATT-3′;产物长度:327 bp。AngⅡ引物:上游:5′ -ATCGGGACC AAT CAC ACT ACA -3′; 下游:5′ -CGT CTC TTCCGG CTG CTT CAA-3′;产物长度: 216 bp。扩增产物2% , 琼脂糖凝胶电泳, 凝胶分析系统测定各条带积分光密度值。采用2-ΔΔCt 方法对实时定量 PCR 结果进行分析,显示miRNA-137、AngⅡRNA 的表达。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组大鼠血压和心肌胶原含量的变化

与对照组比较，SHR组大鼠的收缩压和舒张压明显升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表达水平明显升高，miRNA-97a表达水平明显降低(P<0. 01)(表2)。

表2 两组大鼠的资料与心肌胶原含量的变化(mean ± SD. n=10)Tab.2 Information and myocardial collagen changes of two groups

2.2 两组大鼠心肌组织 Masson 染色结果

SHR 组大鼠心肌细胞间可见大量蓝色胶原纤维沉积，细胞数量减少，体积增大，细胞排列紊乱，对照组大鼠可见红色心肌细胞间隙散在少量蓝色胶原纤维，细胞排列整齐紧密，数量，体积大致正常(图1)。

注：A:对照组;B :SHR组。

2.3 免疫组织化学法检测大鼠心肌组织 TGF-β 1 蛋白表达

TGF-β 1主要在成纤维细胞表达，分布在细胞膜、细胞质及细胞间隙，SHR 组心肌可见 TGF-β 1 大量表达，对照组心肌有仅有少量TGF-β 1 表达(图 2)。SHR组心肌TGF-β 1 蛋白表达水平显著高于对照组(1. 29±0.22vs 0. 70±0. 11，P<0. 01)。

2.4 Real-time PCR检测大鼠心肌组织 miRNA-97a 表达

SSHR组心肌 miRNA-97a 表达水平为对照组的 (24. 6 ±4. 7)%，其 miRNA-97a 表达水平较对照组明显降低(P<0. 01)，

2.5 组间 TGF-β1，Smad3 蛋白和Col-Ⅰ/ Col-Ⅲ蛋白表达比较

SHR对照组大鼠心脏表达TGF-β1/Smad3蛋白和Col-Ⅰ/ Col-Ⅲ蛋白均较正常对照组明显升高(P<0. 01)(图4)。

注：A:对照组;B :SHR 组。

图3 大鼠心肌组织 TGF-β1 蛋白表达改变Fig.3 TGF-β1 expression changes of myocardium

注： 1.正常对照组，2.SHR 对照组，3.SHR 干预组，SHR对照组组与正常对照组比较P<0. 05。

2.6 大鼠心肌组织 miRNA-97a 与 TGF-β 1 蛋白表达

水平相关性分析Pearson 直线相关分析显示，SHR 组心肌组织miRNA-97a 表达水平与 TGF-β1蛋白表达水平呈显著负相关(r=-0. 785，P<0. 01)。

3 讨论

高血压是冠心病的一个独立危险因素[7],冠心病症状为胸腔中央发出疼痛，而且可蔓延到手臂、颔、颈、后背及胃部。冠心病发作的其他症状有气促、眩晕、寒颤、出汗、恶心及昏厥。严重的一些患者会因为心力衰竭而导致死亡[8-9]。

据报道结果[11-13]表明，miRNA-9和miRNA-97a能影响心肌细胞的增殖与分化并且可以通过TLX和周期蛋白D1调控心肌细胞分化。这次实验是为了研究miRNA-97a在心肌重构中的影响，让miRNA-97a成为高血压、冠心病等疾病的一个新的治疗靶点。

本研究发现，大鼠心肌组织 miRNA-97a 表达：Real-time qPCR 结果显示,SHR 组心肌 miRNA-97a 表达水平较对照组明显降低(P < 0. 01),SHR组心肌 miRNA-97a 表达水平为对照组的 (24. 6 ±4. 7)%。大鼠心肌组织 miRNA-97a 与 TGF-β 1 蛋白表达呈显著负相关(r=-0. 785,P<0. 01)。

同时，在本研究中，两组大鼠心肌组织Masson染色结果显示：SHR 组大鼠心肌细胞数量减少，细胞排列紊乱，体积增大，可见大量蓝色胶原纤维。SHR组大鼠收缩压和舒张压显著升高，细胞肥大，体积增大，心肌细胞数量减少，排列紊乱，胞核变圆畸形。同时，SHR对照组表达TGF-β1蛋白表达均上调，表明TGF-β1在 Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表达中有了正性的调节作用。本研究两组大鼠血压和心肌胶原含量的变化显示，和正常组相比，SHR组的收缩压和舒张压明显升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表达水平明显升高，miRNA-97a表达水平明显降低。

TGF-β 1是公认的促纤维化细胞因子,能促进心肌纤维化[14]，本研究显示，特异低表达心脏 miRNA-97a 可促进TGF-β 1 蛋白合成，导致细胞外基质 Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ大量增生和过度积聚，最终导致心肌细胞肥大，纤维化，出现心肌病理性重构[17]。由于在心肌重构过程中参与调控TGF-β 1、AngII表达的机制非常复杂, miRNA-97a具体通过下调哪一种信号通路来抑制细胞的增殖, 还需要我们进一步研究。

[1] Pinto YM，Philipp T，Engler S，etal. Reduction in left ventricular messenger RNA for transforming growth factorβ1 attenuates left ventricular fibrosis and improves survival without lowering blood pressure in the hypertensive TGR (mRen2) 27 rat[J]. Hypertension，2000，36(5): 747-754.

[2] Ziada AM. Additional salutary effects of the combination of exercise training and an angiotensin-converting enzyme inhibitor on the left ventricular function of spontaneously hypertensive rats[J]. Hypertens，2009，27(6): 1 309-316.

[3] He JF，Luo YM，Wan XH，etal. Biogenesis of miRNA-137 and Its Role in Biogenesis，the Cell Cycle，and Apoptosis[J]. J Biochem Mol Toxicol，2011，25(6) : 404-408.

[4] Weber KT，Brilla CG. Signals for the remodeling of the cardiac interstitium in systemic hypertension[J]. Cardiovase Pharmacol，1991，17(Suppl 1): 14-19.

[5] Weber KT，Brilla CG. Myocardial fibrosis and the rennin-angiotensin-aldosterone system[J]. Cardiovase Pharmacol，1992，20(Sup-pl 1): 14-19.

[6] 刁雪红，申锷，等. 糖尿病小鼠心肌组织 microRNA 表达谱分析[J]. 上海交通大学学报，2010，10(2): 1194-198.

[7] Wang YS，Wang HY，Liao YC，etal. MicroRNA-137 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and prevents neointimal formation[J]. Cardiovascular Res，2012，95(4) : 517-526.

[8] Akiyama-Uchida Y，Ashizaua N，Chtwuyu A，etal. Norepinephrine enhances fibrosis mediated by TGF-beta in cardiac fibroblasts[J].Hypertension，2002，40(2): 148-154.

[9] Li JZ，Peng J，Wang CJ，etal. Calcitonin gene-related peptide suppresses isoprenaline-induced cardiomyocyte apoptosis through regulation of microRNA-1 and microRNA-133a expression[J]. J Cent South Univ(Med Sci)，2011，36(10): 964-971.

[10] 王泽慧，边云飞，卫 娜，等. 大鼠 microRNA-145 慢病毒表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞表型转化的影响[J]. 中国动脉硬化杂志，2012，20(5): 424-428.

[11] Liu, Z.Q. Teng, A.L. McQuate,etal. An epigenetic feedback regulatory loop involving microRNA-195 and MBD1 governs neural stem cell differentiation,PLoS One， 2013，22(8): e51436.

[12] C. Zhao, G. Sun, S. Li,etal. A feedback regulatory loop involving microRNA-9 and nuclear receptor TLX in neural stem cell fate determination, Nat. Struct.Mol. Biol.2009，16(5)365-371.

[13] C. Zhao, G. Sun, S. Li,etal. MicroRNA let-7b regulates neural stem cell proliferation and differentiation by targeting nuclear receptor TLX signaling, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (2010) 1876-1881.

[14] Van Rooij E，Sutherland LB. A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，10(3): 18 255-260.

[15] Shi Y，Massague J. Mechanisms of TGF-β signaling from cell membrane to the nucleus[J]. Cell，2003，113(6): 685-700.

[16] Van Rooij E，Sutherland LB. Qi X，etal. Control of stress dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA[J]. Science，2007，316(5 824): 575-579.

[17] Zhu H，Yang Y，Wang Y，etal. MicroRNA-137 promotes palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes by down-regulating Sirt1[J]. Cardiovascular Res，2011，92(1) : 75-84.

Expression of microRNA-97a and TGF-β1 protein in myocardium of spontaneously hypertensive rats and its significance

ZHENG Jing

(Affiliated hospital of Guizhou medical university, Guiyang 550001, China)

ObjectiveTo observe the changes of microRNA-97a and transforming growth factor β 1 (TGF-β1) protein in the myocardium of spontaneously hypertensive rats (SHR). Methods 8 male spontaneously hypertensive(SHR)rats as SHR group, 8 male Wistar rats for control group, Arterial blood pressure was detected by a noninvasive blood pressure measurement and analysis system. 8 weeks after femoral artery，HE staining was used to observe the changes of morphology of the rat heart, the expression of miRNA-97a was checked by Real-time PCR method for detection of rat heart. Western blot was used to detect the TGF-β 1, angiotensin II (Ang II) protein and type I collagen (Col I) and type III collagen (Col III) protein expression level.ResultsIn SHR group, systolic blood pressure and diastolic blood pressure increased significantly, TGF -β1 protein and Col I and Col III protein expression levels increased significantly, miRNA-97a expression levels were significantly lower than that of control group (P< 0. 01). Real-time PCR results showed that the level of miRNA-97a expression in SHR group was (24.6 + 4.7)% in control group, the expression level of miRNA-97a in SHR group was negatively correlated with the expression of TGF-β1 (r=0.785,P< 0.01) in group. Conclusion The level of miRNA-97a is down-regulated along with the up-regulation of TGF-β 1 protein expression and collagen synthesis in the myocardial tissues of SHR. miRNA-97a and TGF-β 1 may be involved in myocardial fibrosis in SHR.

MicroRNA-97a; Transforming growth factor β 1(TGF -β1); Spontaneously hypertensive rats; Myocardial fibrosis

贵州省科技合作计划项目支助(黔科合LH字(2015)7423)。

郑婧，博士，讲师，E-mail：843165396@qq.com。

郑婧。

【文献标识码】 A 【文章编号】1671-7856(2016) 11-0072-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.013

2016-07-20