丹酚酸A对心肌缺血再灌注损伤大鼠心率变异性和心肌损伤的影响

王木兰，潘永明，金 敏，徐孝平，王德军，马全鑫，陈民利

(1.正大青春宝药业有限公司，杭州 310023；2.浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州 310053)



研究报告

丹酚酸A对心肌缺血再灌注损伤大鼠心率变异性和心肌损伤的影响

王木兰1，潘永明2，金 敏1，徐孝平2，王德军2，马全鑫2，陈民利2

(1.正大青春宝药业有限公司，杭州 310023；2.浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州 310053)

丹酚酸A；心肌缺血再灌注损伤；心率变异性；抗氧化；大鼠

缺血性心脏病是导致死亡和致残的主要原因，常与急性冠脉栓塞有关。临床上主要以溶栓或经皮冠脉介入治疗为主，但随后再灌注诱发的心脏功能障碍包括心肌顿抑、心律失常和细胞凋亡，常被称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MI/RI)[1]。研究发现心脏植物神经功能失衡与心源性猝死发生密切相关，而心率变异性(heart rate variability, HRV)作为预测心血管事件和心源性猝死发生的一种无创性指标已被临床所证实[2]，能客观反映交感神经和迷走神经活性变化及其均衡性。丹酚酸A(salvianolic acid A，SAA)是丹参一种水溶性酚酸类化合物，具有显著的抗氧化、抗血栓、抗肝纤维化、抗心肌缺血和神经保护作用[3]。已有研究表明，丹酚酸A对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用[4-5]。但丹酚酸A对MI/RI模型大鼠心电图和心率变异性的影响还尚未见报道。为此，本研究基于心电图观测和HRV分析技术，探讨丹酚酸A对MI/RI大鼠HRV和心肌损伤的影响，为丹酚酸A改善心脏植物性神经调控提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，SPF级，300～350 g，上海斯莱克实验动物有限公司提供【SCXK(沪)2012-0002】；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障系统【SYXK(浙)2013-0184】，室温为22±1℃，相对湿度为50%～70%，饲喂全价营养颗粒饲料，自由饮水。

1.2 主要仪器及药物试剂

1.3 分组

60只大鼠随机分为伪手术(sham)组，心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)模型组，SAA 高、中、低(2、1、0.5 mg/kg)剂量组，阳性对照(2 mg/kg Diltiazem)组；每组10只。

1.4 方法

1.4.1 大鼠 MI/RI模型的制备

术前禁食12 h，以3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(1.5 mL/kg)大鼠，仰卧位固定于手术台，用针形电极刺入四肢皮下，无创生理信号遥测处理系统记录大鼠II导联心电图，气管插管，接ALC-V9呼吸机通气(频率为60次/min，呼吸比率为2∶1，潮气量为30 mL/kg)。于胸骨左侧第四肋间切口，开胸暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间的左冠状动脉(LAD)起始下方2～3 mm处，用6-0医用无损伤带线缝合针于左心耳下方进针，将缝合线穿于自制的冠脉阻断塑料管。然后分别尾静脉注射给予相应药物，MI/RI模型组和伪手术组给予等体积5%葡萄糖氯化钠注射液，给药容量为5 mL/kg。除伪手术组缝合线空置、不拉紧缝合线外，其它组给药10 min后拉紧缝合线，以塑料管球端压迫结扎LAD 30 min后，放松结扎线，再灌注2 h。以左室前壁紫绀和同步心电图II导联J点(QRS波群与T波交点)增高为结扎成功标志，以左室前壁由紫绀逐渐红润和J点降低1/2为再灌注成功标志。

1.4.2 心电图检测和HRV分析

用EMKA无创生理信号遥测处理系统，监测和记录各组大鼠II导联心电图，采样频率为 1 000 Hz。然后用ECG-AUTO V3.2.0.2分析软件，进行模块化分析大鼠在结扎前、缺血期、再灌注5～120 min时的心电图J点变化，计算在再灌注期J点总和(-J)、J点平均值(Average of J point)、J点的最低值(minimum of J point)和最大值(maximum of J point)。同时自动分析连续 RR间期(RRI)，并手工剔除异常的RRI后，行HRV分析，时域指标包括RR间期的标准差(SDNN)，相邻RR间期差值平方和的均方根(RMSSD)，HRV三角指数(tr.Ind)；按文献[6]行Hamming快速分析RR间期功率谱，获取极低频波谱VLF(0.003～0.04 HZ)、低频波谱LF(0.04～1Hz)、高频波谱HF(1～3 Hz)和总功率(TP)，并对LF和HF进行标准化，计算[LFnu或HFnu=LF或 HF/(TP-VLF)×100]和平衡指数LF/HF。

1.4.3 生化指标测定

大鼠心肌缺血再灌注损伤2 h后，取腹主静脉肝素抗凝血，在7020生化分析仪上测定血浆AST、LDH、CK和CK-MB活性，并在DU-800紫外/可见分光光度计上测定血浆SOD、MDA和NO水平，所有检测均按试剂盒说明书进行。

1.4.4 伊文思蓝和TTC双重染色测定心肌梗死面积

按文献方法[7]，从大鼠右心室注射5%伊文思蓝1 mL；2 min后待大鼠巩膜蓝染后，立即从右心室注射10% 氯化钾溶液使心脏停跳，迅速取出心脏，置入2%的琼脂糖PBS缓冲液2 min后，剔除右心室和心耳等组织，放入-20℃冰箱中冷冻20 min后，将心肌每隔2 mm横断切成5片，置入1% TTC溶液中，37℃孵育15 min。伊文思蓝染色区为非缺血区，TTC染色区为红色的，表明缺血仍存活组织为危险区(AAR)，非TTC染色区为灰白色，表明为梗死区(IS)，行数码拍照后，用Image-J图像分析软件进行面积分析，并计算梗死区(IS)占危险区(ARR)的百分比。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 SAA对MI/RI大鼠心电图J点的影响

与伪手术组比，MI/RI模型大鼠心电图J点冠脉结扎后明显抬高(P<0.01)，再灌注后J点有所降低，但各时间点仍显著高于伪手术组(P<0.01)，同时再灌注期-J值和J点平均值均显著高于伪手术组(P<0.01)。与MI/RI模型组比，高、中、低剂量的SAA组和地尔硫组大鼠再灌注期心电图J点曲线均低于MI/RI模型组(P<0.05,P<0.01)。地尔硫组和2 mg/kg SAA组均能显著降低再灌注期大鼠J点最低值、-J值和J点平均值(P<0.05，P<0.01)；且0.5 mg/kg和1 mg/kg SAA组亦能显著降低再灌注期大鼠-J值和J点平均值(P<0.05)(图1)。

注：不同时间点J点(A)，缺血期J点(B)，再灌注期J点最低值(C)和J点最大值(D)，再灌注期总J点(E)和J点平均值(F)；与伪手术组比，ΔΔP<0.01；与MI/RI模型组比，*P<0.05，**P<0.01；。

2.2 SAA 对MI/RI大鼠心肌梗死的影响

注：心肌伊文思蓝和TTC双重染色结果(A)和IS/ARR(B)；与伪手术组比，ΔΔP<0.01；与MI/RI模型组比，*P<0.05，**P<0.01；。

2.3 SAA对MI/RI大鼠血浆心肌酶的影响

2.4 SAA对MI/RI大鼠HRV的影响

2.5 SAA对MI/RI大鼠SOD、MDA和NO含量的影响

注：AST(A)，LDH(B)，CK-MB(C)和CK(D)；与伪手术组比，ΔΔP<0.01；与MI/RI模型组比，*P<0.05，**P<0.01；。

注：RR间期(A)，SDNN(B)，RMSSD(C)，tr. Ind(D)，TP(E)，LFnu(F)，HFnu(G)和LF/HF(H)；与伪手术组比，ΔΔP<0.01；与MI/RI模型组比，*P<0.05，**P<0.01；。

注：SOD(A)，MDA(B)和 NO(C)；与伪手术组比，ΔΔP<0.01；与MI/RI模型组比，*P<0.05，**P<0.01；。

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤可引起心肌细胞膜受损、细胞变性或坏死，使得细胞膜通透性增高，导致心肌细胞内的AST、LDH、CK等酶漏出并释放入血，故心肌受损程度与CK、LDH等酶呈正相关[9]。另外，再灌注损伤时，由于大量的氧自由基产生和细胞膜脂质过氧化反应增强，进而影响心肌细胞膜的流动性，同时血管内皮细胞受损又可引起内源性NO合成减少，导致血中SOD活性和NO水平的下降，MDA含量的升高，这些可能是导致心肌缺血损伤的原因之一[10]。本研究结果显示，丹酚酸A能明显抑制心肌缺血再灌注损伤所致血浆AST、LDH、CK和CK-MB活性的升高，并能明显提高血浆NO含量，降低血浆MDA含量，从而抑制心肌脂质过氧化，保护血管内皮和保护心肌的作用，这与减少心肌梗死面积的结果较为一致。

大量的研究表明，交感神经活性的增强和/或迷走神经活性的减弱，均会使HRV值降低，HRV是预测心血管事件发生的重要指标。HRV参数中SDNN可反映交感和迷走神经张力的变化，与HRV三角指数tr. Ind一样均可反映总的HRV变化；RMSSD反映迷走神经张力，并与心率快速变化有关。频域分析中HF与迷走神经活性有关，LF与交感神经活性有关，也有学者认为LF受交感神经和迷走神经的共同活动。TP反映HRV的总和；LF/HF比值反映了交感神经和迷走神经系统的均衡性[2]。另外，氧化应激可加剧脂质过氧化反应，促进儿茶酚胺的释放，激活NF-κB/促炎因子通路，导致内皮细胞和神经元细胞坏死或凋亡等，使得心血管系统交感-副交感神经系统失衡，甚至可引起心肌梗死或心肌缺血。同时，心肌缺血又可进一步激发交感神经系统的兴奋性，导致血浆和心脏中儿茶酚胺持续增高，最终导致HRV降低，大大增加了心肌梗死、心脏性猝死的发生率[11-12]。此外，临床显示冠心病病人存在低HRV和自主神经功能失调；而HRV的降低与心肌缺血缺氧对化学感受器、心室壁机械的刺激引发心脏自主神经调节失衡[13]。同样本研究发现MI/RI模型大鼠SDNN、tr. Ind、TP、RMSSD和HFnu均降低显著，LFnu和LF/HF比值均明显升高，提示MI/RI模型大鼠出现明显HRV降低，主要表现在交感神经活性相对亢奋，迷走神经活性则显著抑制，这可能与氧化应激导致心脏植物神经系统失衡，促发心肌缺血有关。相反，丹酚酸具有较强的抗氧化和抑制NF-κB/促炎因子通路的激活[14]，给予丹酚酸A后能明显提高SDNN、tr.Ind、RMSSD、HFnu，降低LFnu和LF/HF比值，并减慢心率，表明丹酚酸A通过抗氧化作用，抑制自由基产生和炎性因子释放，保护内皮细胞，同时扩张冠脉血管和降低心肌耗氧，提高迷走神经活性，从而改善心脏自主神经调控，减少心律失常的发生，这也可能是丹酚酸A抗心律失常发生的作用途径之一[15]。

由此可见，丹酚酸可增加MI/RI大鼠的HRV，减少心肌梗死面积，其作用机制与丹酚酸A的抗氧化作用有关。

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Effects of salvianolic acid A on heart rate variability and myocardial injury in myocardial ischemia reperfusion injured rats

WANG Mu-lan1, PAN Yong-ming2, JIN Min1, XU Xiao-ping2,WANG De-jun2, MA Quan-xin2，CHEN Min-li2

(1. Chiatai Qingchun Bao Pharmaceutical Co., Ltd.Hangzhou 310023;2. Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053,China)

Objective To observe the effects of Salvianolic acid A (SAA) on heart rate variability (HRV) and myocardial injury in myocardial ischemia reperfusion injured (MI/RI) rats. Methods Sixty SD rats were divided into 6 groups randomly (n=10); the sham group, the MI/RI model group, high, middle and low-dose SAA group (2 mg/kg, 1 mg/kg and 0.5 mg/kg) and positive control group (2 mg/kg Diltiazem). The MI/RI model was made by ligating the left anterior descending branch of coronary artery in rats. Before ligation, the rats were intravenously administered with corresponding drugs. The changes of electrocardiogram of J point and HRV parameters were analyzed. At the end of reperfusion, the myocardial infarct size was measured by using Evans blue and tetrazolium chloride (TTC) double staining. The changes of plasma aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) and its isoenzyme (CK-MB), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (no) content were also detected. Results Compared with MI/RI model group, SAA low, middle and high dose group and Diltiazem group were significantly reduced the total or average value of J point during reperfusion(P<0.05,P<0.01),reduced myocardial infarct size and inhibited the rising of AST, CK-MB and CK activities(P<0.05,P<0.01), and increased the standard deviation of RR intervals (SDNN), the root-mean-square of successive differences (RMSSD), HRV triangle index (tr. Ind) and high frequency (HFnu), reduced the low frequency (LFnu) and the ratio of LF/HF(P<0.05,P<0.01). Moreover, SAA could significantly increase the content of NO and reduce the content of MDA (P<0.05). Conclusion SAA could increase HRV and reduce myocardial infarction area in MI/RI rats, its mechanism of action maybe related with antioxidant effects.

Salvianolic acid A; Myocardial ischemia reperfusion injury; Heart rate variability; Anti-oxidation; Rats

浙江省中医药管理局重点项目(2015ZZ009)；浙江中医药大学比较医学创新团队( XTD201301)。

王木兰(1983-)，女，工程师，研究方向：中药药理。E-mail:qcbwml@163.com。

陈民利(1963-)，女，教授，研究方向：实验动物与比较医学。E-mail: cmli991@ aliyun.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0024-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.005

2016-06-30