Parkin基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用

江波 倪海峰 周珍 李勇 黄光武

Parkin基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用

江波 倪海峰 周珍 李勇 黄光武

目的 探讨Parkin基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR技术对5个鼻咽癌细胞株（CNE1、CNE2、TW03、HONE1、C666）和1个正常鼻咽上皮细胞株（NP69）、54例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽上皮组织的Parkin基因启动子区甲基化状态进行检测，并分析鼻咽癌组织中Parkin基因甲基化与临床特征的关系；应用RT-PCR检测加入甲基转移酶抑制剂（5-氮-2-脱氧胞苷）后CNE1、CNE2中Parkin基因转录表达，分析去甲基化对Parkin基因转录表达的影响。结果1个正常鼻咽上皮细胞株和16例正常鼻咽上皮组织中均未检测到Parkin基因甲基化；5个鼻咽癌细胞株和54例鼻咽癌组织中Parkin基因甲基化频率分别为60.00%和62.96%；54例鼻咽癌患者中Parkin基因甲基化状态与临床因素均无关（均P＞0.05）。经过5-氮-2-脱氧胞苷处理后，Parkin基因在CNE1、CNE2中转录表达增加，分别从0提高至3.65和2.15。结论 鼻咽癌中Parkin基因甲基化与转录表达密切相关，是基因表达调节的一种重要方式；可能成为鼻咽癌早期分子生物学辅助诊断的标志物和去甲基化基因治疗的靶点。

Parkin基因 鼻咽癌 甲基化 5-氮-2-脱氧胞苷

【 Abstract】 Objective To investigate the methylation of Parkin gene promoter in nasopharyngeal carcinoma(NPC). Methods The methylation-specific PCR(MSP)was used to detect methylation status of Parkin gene promoter in 54 specimens of NPC tissues and 16 specimens of normal nasopharyngeal epithelia(NNE)tissues,as well as in 5 NPC cell lines(CNE1,CNE2, TW03,HONE1,C666)and 1 normal nasopharyngeal epithelia cell line(NP69).The expressionof Parkin mRNA in NPC cell lines CNE1 and CNE2 were analyzed before and after treatment with the methyltransferase inhibitor 5-aza-2-deoxycytidine.In addition,alterations of mRNA expression of Parkin gene were detected by semi-quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR).The relationship between promoter methylation and clinicalfeatures,demethylation and expression of Parkin mRNA was analyzed.Results Methylation ofParkin promoter was detected in 60.00%(3/5)NPC celllines and 62.96%(34/54)NPC tissue specimens,but not in NNE tissues and NP69 cells.There was no significant association between Parkin promoter methylation andclinical features of NPC(P＞0.05).After 5-aza-2-deoxycytidine treatment,the expression of Parkin mRNA was increased in CNE1 and CNE2 cells. Conclusion The close correlation between Parkin methylation and low mRNA expression suggests that methylation might be associated with the regulation of gene expression.Parkin gene promoter methylation has high specificity in distinguishing cancers from normal tissues,which indicates methylation of Parkin promoter may provide a novel molecular target for diagnosis and treatment ofNPC.

研究证实大多数癌症中Parkin基因主要表现为杂合性缺失，而甲基化鲜有报道；目前仅见在急性淋巴细胞性和慢性粒细胞性白血病中Parkin基因甲基化的报道。本研究采用甲基化特异性PCR对鼻咽癌组织及其细胞株、正常鼻咽上皮组织及其细胞株的Parkin基因启动子区甲基化状态进行检测，以探讨Parkin基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用。

1 对象和方法

1.1对象 16例正常鼻咽上皮组织标本取自鼻窦内镜手术和扁桃体切除术患者，54例鼻咽癌组织取自广西医科大学第一附属医院和杭州市第一人民医院2008—2011年耳鼻咽喉科就诊的新发鼻咽癌患者，均为新鲜活检病理组织。切除组织后立即冻存于－80℃冰箱内备用。1个永生化正常鼻咽上皮细胞株（NP69）由香港大学医学院解剖学教研室George Tsao教授惠赠。取1位健康青年外周血淋巴细胞作甲基化、非甲基化的特异性PCR阳性对照标本。本实验通过医院伦理委员会批准，采集标本前与患者或志愿者签订知情同意书。

1.2 主要试剂 Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品；M-MLV逆转录酶为美国Promeag公司产品；DNA的亚硫酸氢盐修饰所需试剂（Hydroquinone、低熔点琼脂糖、矿物油、Sodium metabisulphite）和5-氮-2-脱氧胞苷均为美国Sigma公司产品；甲基化酶试剂盒为新英格兰BioLabs公司产品；TaKaRa Ex Taq耐热性DNA聚合酶、二甲基亚砜、Marker均为大连宝生物工程有限公司产品，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用经典的蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法，分别从组织、细胞株和外周血淋巴细胞中提取DNA。用紫外分光光度仪检测A260、A280，计算浓度、A260/A280。

1.2.2 外周血淋巴细胞DNA的CpG甲基化酶修饰 取1μgDNA、2μl 10×反应缓冲液、0.1μl 200×S-腺苷甲硫氨酸、1U CpG甲基化酶，加水至20μl，37℃温育1h；完成以上步骤后进一步作DNA的亚硫酸氢盐修饰，作为甲基化阳性对照。

1.2.3 DNA的亚硫酸氢盐修饰 将组织、细胞株和外周血淋巴细胞中提取的DNA，经CpG甲基化酶处理的DNA分别作亚硫酸氢盐修饰，实验步骤参照相关文献[1]进行。外周血淋巴细胞中提取的DNA经亚硫酸氢盐修饰后，作为非甲基化阳性对照。

1.2.4 甲基化特异性PCR Parkin基因甲基化、非甲基化特异性PCR引物序列，见表1。甲基化特异性PCR程序（197bp）：95℃预变性3min，94℃30s、63℃20s、72℃20s 37个循环，最后延伸72℃5min。非甲基化特异性PCR程序（197bp）：95℃预变性3min，94℃30s、61℃20s、72℃20s 37个循环，最后延伸72℃5min。2%的琼脂糖凝胶电泳分析。正常外周血淋巴细胞中提取的DNA作为非甲基化阳性对照，CpG甲基化酶修饰后正常外周血淋巴细胞DNA模板作为甲基化阳性对照，去离子水作为空白对照。阳性（甲基化）标本：仅有甲基化引物特异性扩增产物或甲基化和非甲基化引物均有特异性扩增产物；阴性（非甲基化）标本：仅有非甲基化引物特异性扩增产物。

表1 Parkin基因甲基化及非甲基化特异性PCR引物序列

1.2.5 细胞培养和去甲基化处理 在6孔板中，以每孔2×105个细胞的浓度接种CNE1、CNE2细胞，次日更换为含10μmol/L 5-氮-2-脱氧胞苷的完全IMDM培养基，每24h更换含药培养液，96h后提取细胞总RNA，逆转录后用RT-PCR检测Parkin基因mRNA表达。用含10μmol/L二甲基亚砜的完全IMDM培养基进行培养液处理的细胞作为对照组。

1.2.6 总RNA提取和第一链cDNA的合成 采用Trizol试剂一步法提取细胞和组织总RNA，用紫外分光光度仪检测A260、A280，计算浓度、A260/A280。反转录采用Promega公司的M-MLV逆转酶，按照操作手册进行第一链cDNA的合成。

1.2.7 RT-PCR Parkin基因RT-PCR引物序列，见表2。RT-PCR程序经过预实验确立，循环数均在指数扩增期，具体如下：Parkin（456bp）：95℃预变性3min，94℃30s、57℃30s、72℃30s 30个循环，最后72℃延伸5min；β-actin（621bp）：95℃预变性3min，94℃30s、58℃30s、72℃30s 28个循环，最后72℃延伸5min。正常鼻咽上皮组织作阳性对照，去离子水作空白对照。2%的琼脂糖凝胶电泳，应用Quantity One软件分析各条带的灰度值，各组织样本Parkin基因片段与相应模板β-actin片段灰度值的比值，即表达量。

表2 RT-PCR引物序列

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或四格表资料的Fisher确切概率法。

2 结果

2.1 人群基线资料 54例鼻咽癌患者中，男39例，女15例；年龄20～78岁，中位年龄45.8岁；参照国际抗癌联盟2010年第7版临床TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳa期12例；淋巴结转移36例，远处转移0例；M0期54例，M1期0例；病理诊断参照2005年WHO分型：非角化性癌48例，角化型鳞状细胞癌6例，基底细胞样鳞状细胞癌0例。16例正常鼻咽上皮组织健康志愿者中，男11例，女5例；年龄18～68岁，中位年龄42.5岁。两组性别、年龄方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 Parkin基因启动子区甲基化状态 5个鼻咽癌细胞株（CNE1、CNE2、TW03、HONE1、C666）和54例鼻咽癌组织中Parkin甲基化频率分别为60.00%（3/5）和62.96%（34/54）；1株正常鼻咽上皮细胞株（NP69）和16例正常鼻咽上皮组织中均未检测到甲基化，见图1。

图1 Parkin基因启动子区甲基化状态的电泳图（M：甲基化特异性PCR；U：非甲基化特异性PCR；MK：Marker；CNE1、CNE2、TWO3、HONE1、C666：鼻咽癌细胞株；NP69：正常鼻咽上皮细胞株；T1、T2、T3：鼻咽癌组织；N1、N2、N3：正常鼻咽上皮组织；PC：阳性对照；H2O：阴性对照）

2.3 Parkin基因启动子区甲基化状态与临床特征的关系 不同年龄、性别、T分期、N分期、TNM分期、病理类型的鼻咽癌患者Parkin基因启动子区甲基化频率差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表3 54例鼻咽癌患者Parkin基因启动子区甲基化状态与临床特征的关系

2.4 5-氮-2-脱氧胞苷对Parkin基因转录表达的影响 对Parkin基因甲基化的2个鼻咽癌细胞株（CNE1、CNE2）应用甲基转移酶抑制剂（5-氮-2-脱氧胞苷）进行去甲基化处理，采用RT-PCR检测去甲基化处理前后Parkin基因转录表达情况，发现去甲基化处理后Parkin基因的mRNA表达明显提高，CNE1转录表达水平从0提高至3.65，CNE2从0提高至2.15，见图2。

图2 5-氮-2-脱氧胞苷对鼻咽癌细胞株（CNE1、CNE2）Parkin转录表达影响的电泳图（5-aza-dc:5-氮-2-脱氮肥苷，-：二甲基亚砜；+：5-氮-2-脱氧胞苷；NNE：正常鼻咽上皮组织，即阳性对照；H2O：阴性对照）

3 讨论

启动子区异常甲基化是肿瘤抑制基因灭活的基本机制。经典的癌基因、抑癌基因的遗传学改变在鼻咽癌中较为罕见，鼻咽癌是一种高频率的基因CpG岛甲基化的肿瘤，DNA甲基化引起的抑癌基因失活在鼻咽癌的抑癌基因改变中起着重要作用，涉及细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡和肿瘤浸润转移的众多基因[2]。Parkin基因最初发现是帕金森病的致病基因，Parkin基因参与蛋白质的泛素化过程，其功能缺陷诱导多巴胺能神经元选择性死亡，导致帕金森病。近年来研究证实Parkin基因与乳腺癌[3]、卵巢癌[4]、胶质细胞瘤[5]、肾癌[6]和白血病[7]等多种肿瘤关系密切，但在肿瘤中的具体作用尚未明确。Tay等[3]研究发现在Parkin基因缺失的乳腺癌细胞系中加入外源性Parkin蛋白，会导致细胞增殖和迁移能力减弱，主要作用机制是通过增强细胞周期依赖性蛋白激酶6表达来抑制乳腺细胞增殖，使细胞停留在G1期，从而实现肿瘤抑制功能。Lee等[8]研究发现Parkin基因可调节细胞有丝分裂，其缺陷会引起细胞基因组不稳定性，促进肿瘤发生。

本研究结果显示Parkin基因甲基化只发生在鼻咽癌中，具有肿瘤特异性，且其甲基化状态与其他临床因素无关，提示Parkin基因启动子区甲基化可能在鼻咽细胞癌变早期即已发生，参与了鼻咽癌进展的全过程，或许能成为早期分子生物学诊断的标志物。Agirre等[7]报道Parkin基因甲基化与FAB分型、完全缓解率、复发率、死亡率、11年无瘤生存率和12年总存活数等无关，与本研究结果类似。此外，Agirre等[7]研究证实在26%的急性成人或儿童淋巴细胞性白血病患者中可检测到Parkin基因甲基化，且Parkin基因甲基化导致其表达下调，表明转录表达受甲基化调控；而本研究结果显示鼻咽癌中Parkin基因转录表达水平受DNA甲基化调控，可见Parkin基因甲基化在急性淋巴细胞性白血病与鼻咽癌中作用相似。

DNA甲基化是一个可逆的过程，去甲基化药物可以逆转因甲基化失活的肿瘤抑制基因对细胞的恶性转化过程[9]。本研究应用甲基转移酶抑制剂（5-氮-2-脱氧胞苷）对CNE1、CNE2去甲基化处理后，Parkin基因的mRNA表达明显提高，提示DNA的甲基化调节是鼻咽癌中Parkin基因表达调节的重要方式，有别于多数癌症中等位基因缺失是Parkin基因表达调节机制[10-12]。此外，由于Parkin基因产物具有抑制细胞分裂与增殖、阻止肿瘤形成的作用，若应用去甲基化药物重新激活其表达就能抑制鼻咽细胞癌变，则具有潜在的基因治疗价值。

综上所述，鼻咽癌中Parkin基因甲基化是其基因表达调节的一种重要方式，Parkin基因甲基化在鼻咽癌发生、发展中起着重要作用，可能成为鼻咽癌早期分子生物学诊断的标志物和去甲基化基因治疗的靶点，有待进一步临床验证。

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（本文编辑：陈丹）

《浙江医学》对医学论文中有关实验动物描述的要求

在医学论文的描述中，凡涉及实验动物者，在描述中应符合以下要求：（1）品种、品系描述清楚，（2）强调来源，（3）遗传背景，（4）微生物学质量，（5）明确等级，（6）明确饲养环境和实验环境，（7）明确性别，（8）有无质量合格证，（9）有对饲养的描述（如饲料型、营养水平、照明方式、温度、温度要求），（10）所有动物数量准确，（11）详细描述动物的健康状况，（12）对动物实验的处理方式有单独清楚的交代，（13）全部有对照，部分可采用双因素方差分析。

本刊编辑部

Methylation of Parkin gene promoter in nasopharyngeal carcinoma

JIANG Bo,NI Haifeng,ZHOU Zhen,et al.Department of Otolaryngology and Head/Neck Surgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

Parkin gene Nasopharyngealcarcinoma Methylation 5-aza-2-deoxycytidine

2016-01-07）

浙江省医药卫生科技一般项目（2011KYA127）；浙江省医药卫生骨干平台项目（2012RCB038）

310006 杭州市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科（江波、倪海峰、周珍、李勇）；广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科（黄光武）

倪海峰，E-mail：nihaifeng138@163.com