建立监测核酸检测系统趋势变化方法的探讨

2016-12-23庄养林熊丽红施桥发

实验与检验医学 2016年6期

关键词：弱阳性核酸阳性

庄养林，熊丽红，施桥发

(1、江西省血液中心，江西南昌330057；2、南昌大学医学院，江西南昌330006)

·输血与检验·

建立监测核酸检测系统趋势变化方法的探讨

庄养林1，2，熊丽红1，施桥发2

(1、江西省血液中心，江西南昌330057；2、南昌大学医学院，江西南昌330006)

目的探讨罗氏核酸检测试剂在多台核酸检测设备应用时建立室内质量控制措施，监测核酸检测设备试验的稳定性。方法应用罗氏核酸检测试剂在罗氏Cobas S201核酸检测系统上对无偿献血标本、核酸检测试剂盒阳性对照品、核酸弱阳性室内质控品进行检测，记录每台检测设备的阳性对照品和弱阳性室内质控品的各检测项目通道的Ct值。应用Excel绘制质量控制图，以检测日期为横坐标，各个项目检测Ct值为纵坐标，形成每台检测设备的各检测项目的质控分析图，通过对各检测设备阳性对照品和弱阳性室内质控品的Ct值标准差、均值，评价各检测设备检测的稳定性。结果各检测设备的阳性对照品及室内质控品的CV值均在5%以内，1A检测设备与1B检测设备比较时，各检测项目P>0.05，1B检测设备与2号检测设备比较时，各检测项目P>0.05，1A检测设备与2号检测设备比较时，各检测项目P>0.05，均无显著性差异。结论各检测设备间检测性能无明显差异，本实验室参照定量数据模式所建立的室内质量控制措施用以监测核酸检测系统趋势变化的方法具有一定的意义。

核酸检测技术；Ct值；罗氏CobasS201核酸检测系统；试验稳定性

核酸检测技术（NAT）在我国应用于采供血机构进行血液筛查的试点工作在2010年启动，随着血站核酸检测工作的全面覆盖以及对血液管理工作要求的提高，为了规范核酸检测的操作流程，进一步提高输血安全水平，国家卫计委组织专家对《血站技术操作规程（2012版）》进行了修订和完善，主要增加和调整了核酸检测有关内容，形成了《血站技术操作规程（2015版）》，其中在4.8.1.1条款中明确说明在血液检测过程中，应对试验性能持续进行监控，以发现正在发生的任何性能变化，这些变化如果没有得到及时纠正，最终可能导致试验批次的失败，或者弱阳性标本的漏检[1]，即监控试验有效性和稳定性，监测系统的趋势变化。对此，我们也进行了相关的监测工作，即统计各核酸检测设备相关检测项目通道记录的Ct值（实时监测过程扩增过程的荧光信号达到指数扩增循环周期数）[2]，进行分析工作，现将有关工作介绍如下。

1 对象与方法

1.1 标本来源选自2016年3月1日-2016年3月31日南昌市无偿献血者标本；罗氏MPX V2.0核酸检测试剂阳性对照品；北京康彻思坦生物技术有限公司核酸质控品，HBV-DNA（50IU/ml）、HCV-RNA（200IU/ml）、HIV-RNA（1000IU/ml）。

1.2 仪器罗氏公司Cobas s 201核酸检测系统，瑞士Hamlton全自动STAR加样仪，长沙湘麓DL-6M大容量低温离心机。

1.3 主要试剂核酸检测试剂盒：COBAS TaqScreen MPX V2.0 test核酸检测试剂盒（瑞士Roche公司，批号：210761），该试剂可同时定性检测人类血浆中的HIV-1，2 RNA、HCV RNA和HBV DNA。

1.4 实验方法

1.4.1 弱阳性质控品的配制将原浓度的HBVDNA（50IU/ml）、HCV-RNA（200IU/ml）、HIV-RNA（1000IU/ml）三种弱阳性质控品各1ml汇集到一支试管中，加入2ml生理盐水充分混匀，形成HBVDNA、HCV-RNA、HIV-RNA终浓度分别为10IU/ ml、40IU/ml、200IU/ml的混合弱阳性室内质控品，即各检测项目在试剂检测下的2~5倍浓度。

1.4.2 制作Levey-Jennings质控图运用罗氏COBAS TaqScreen MPX V2.0 test核酸检测试剂盒对无偿献血者标本进行检测，每批次试验带有阳性对照品及使用康彻思坦公司原浓度配置的混合弱阳性室内质控品。试验结束后应用Excel绘制Levey-Jennings质控图，以检测日期为横坐标，以各个项目检测Ct值为纵坐标，将各个项目检测的Ct值分检测设备绘制在一张Levey-Jennings质控图上。具体做法为：将全部检测设备的相应检测项目的Ct值累积（大于20个）在一起，计算一个批号的阳性对照品及弱阳性室内质控品各项目的总均值及总标准差(SD)，剔除超过±3s的Ct值，重新计算各项目Ct值的总均值及总标准差，形成一个批号的阳性对照品及弱阳性室内质控品各项目的Levey-Jennings质控图框架，随后可将几个月的全部检测设备的各项目Ct值累积，计算出该批号阳性对照品及弱阳性室内质控品的各项目Ct值的总均值及总标准差，形成该批号的各项目的Levey-Jennings质控图框架。每次试验结束后只需将各仪器各项目检测的Ct值输入到Excel表格中即可得到该检测项目在该检测设备上的趋势变化图。

1.4.3 计算每台检测设备相应检测项目的均值(x)、变异系数（CV）及标准差。

1.5 结果判定阴性对照检测结果无反应性为阴性，阳性对照检测结果反应性为阳性，室内质控品各检测项目为反应性；每个混样孔（pool）内标检测结果阳性，本pool检测结果有效；如混样孔内标检测结果阴性，本pool检测结果无效；在阴、阳性对照品检测结果及室内质控品结果均有效时判为本次试验有效，否则为无效。如试验无效，该标本需重新检测。

1.6 统计学方法运用SSPS软件对数据进行统计分析，组间比较采用t检验方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 均值及标准差各核酸检测设备各阳性对照品及弱阳性室内质控品均值及标准差见表1。

2.2 质控图各仪器利用各项目累积总均值及总标准差建立框架形成的部分阳性对照品（CTL）及弱阳性室内质控品（QC）Ct值Levey-Jennings质控图见图1。

3 讨论

实验室采用日常各检测项目的检测结果来进行室内质控这种方法在临床上，尤其是生化定量方面早已有大量运用，主要是将每天的某项检测项目的结果均值绘制质控图，以此来观察检测结果是否失控。但PCR的检测结果与生化定量的检测结果相比则不同，生化定量的检测结果为计量资料，而定性PCR检测结果则为计数资料，后者只有两种结果：阴性或阳性。而且，目前国内采供血机构室内质控品均为低浓度，低浓度的质控品病毒或核酸片段在质控品中分布不均匀，其Ct值与与浓度并不成线性关系，若参照定量方法运用2~5倍LOD(检测下限)浓度质控品进行室内质控，如不能保证质控品的质量以及实验操作员严格按照操作规程操作，很容易造成失控现象。针对此种情况，目前国内采供血机构核酸实验室普遍的做法是采用定性的方法进行质量控制。因核酸检测技术应用于采供血血液筛查实验中在我国还处在早期阶段，如何进行核酸检测的质量控制，进一步提高核酸检测结果的准确性及可靠性也成为国内采供血机构核酸实验室目前正在探索的阶段，国内也有部分实验室采用相似的方法进行了室内质量控制措施，也取得了一定的效果[3-5]。

表1 各核酸检测设备各阳性对照品(CTL)及弱阳性室内质控品(QC)的均值及标准差

图1 Levey-Jennings质控图

本实验室采用的核酸试验室内质控的方法是将每天各检测项目通道的检测Ct值作为计量资料用于室内质控，采用定量数据模式进行质控分析。从三台检测设备累积的数据结果来看，每台检测设备的各个检测项目的CV值都在5%以内，说明各个检测设备各检测项目的均数离散程度较好，试验稳定性较好。通过各组数据间的比较（P> 0.05），反映了三台检测设备之间的差异均无明显区别。通过上图所示，本实验室核酸试验室内质控利用Levey-Jennings质控图，在质控图上正确显示了各质控点，可直观、实时分析血液筛查中核酸检测定性项目的质控数据。绘制的各检测项目Ct值Levey-Jennings质控分析图可以清晰直观地监测检测设备趋势变化，及时发现各检测设备正在发生的任何性能变化、纠正不良因素。通过三台检测设备各个检测项目的Ct值Levey-Jennings质控图来看，除1B号检测设备2016年3月4日室内质控品HBV-DNA项目和1B号检测设备2016年3月16日室内质控品HIV-RNA项目Ct值出现在+3s外，其余各检测设备及检测项目Ct值均在+3s内。而3月4日室内质控HBV-DNA项目的Ct值为36.8，3月16日室内质控品HIV-RNA项目的Ct值为37.0，反映了室内质控品相应的病毒或核酸片段含量较低。在排除了实验操作员的操作原因后，分析可能为病毒在质控品中的呈颗粒分布，在质控品中易分布不均匀导致检测Ct值较高。因罗氏COBAS TaqScreen MPX V2.0 test核酸检测试剂盒中阳性对照品及购买自康彻思坦公司核酸弱阳性质控品浓度是定量的，故各项目检测Ct值理论上也应在一定范围内波动。在排除人为操作因素影响的情况下，如阳性对照品实验前是否充分摇匀、配置弱阳性室内质控品是否按标准操作进行配制等，若某检测项目在某台检测设备上出现有检测Ct值持续升高或降低，通过Levey-Jennings质控图就可以直观看到这种向上或向下的趋势，及时去分析出现的问题，采取相应的措施以解决发现正在发生的任何性能变化。因此，通过监测阳性对照品以及弱阳性室内质控品的Ct值，定期对其进行分析，可以监控试验有效性和稳定性，达到监测系统的趋势变化的目的。

当然采用阳性对照品以及弱阳性室内质控品的Ct值作为监控核酸检测的稳定性还是有一定的局限性的。前期我们已统计过相当量的数据，阳性对照品Ct值的CV一般都在2%以内，Ct值比较稳定难以观察到检测系统趋势变化，且一个批号中会有偶发的个别阳性对照出现阴性的结果，追踪检测过程也无异常现象，从设备、人员操作、环境中都无法找出原因。另外使用弱阳性室内质控品作为监测指标也有一定的局限性，因为对用于室内质控购买的弱阳性质控品的要求也是很高的，一是质控品储存过程中要比较稳定不易降解，二是购买的质控品标识的定量要比较准确，标识过低而实际浓度较高容易造成CV值变异较小，无法监测系统趋势变化，而标识过高实际浓度较低容易造成CV值波动较大、甚至出现阴性结果，对监测核酸检测试验稳定性也无意义。例如我实验室采用的是罗氏核酸检测系统，HCV RNA平均95% LOD（检测下限）仅为6.8IU/ml，室内质控品采用2~ 5倍LOD进行室内质控检测时，若购买到浓度标识过高的质控品（实际浓度较低），就很容易造成CV值较大，室内质控失控，甚至检出阴性结果的现象，无法起到实验室质量控制的作用。

因此在定值浓度的质控品条件下，建立Levey-Jennings质控分析图可以排除人员因素、环境差异所导致的误差，能进一步提高实验室核酸检测结果的准确性及可靠性[6]。但实验人员严格按照操作规程进行操作显得尤为重要，一是注意实验前的充分混匀，因室内质控品病毒核酸终浓度较低，仅为试剂检测下限的2~5倍浓度，若不进行充分摇匀混匀很容易造成病毒核酸在质控品中分布不均匀，吸取检测标本时仅有少量病毒核酸被吸取，造成Ct值过高，甚至病毒核酸检测不出的现象。二是注意室内质控品切忌反复冻融及复融后放置过长时间，这些情况都容易造成病毒核酸破环及降解[7-10]，从而造成病毒核酸检测Ct值过高[11]，甚至阳性质控品出现检测阴性结果的现象。本文旨在探讨罗氏核酸检测试剂在多台核酸检测设备应用时，能否根据各阳性对照及室内质控品各检测项目检测的Ct值，参照定量数据分析的模式，建立Levey-Jennings质控分析图，用以监测核酸检测系统趋势变化的方法，尽管有不完善的地方，但经过运行还是起到了提高实验室质量控制的能力，在今后的工作中，我们也将持续完善实验室室内质量控制措施，提高实验室的检测能力。

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Q751，R523