赣州地区HBV Enh-I/X基因启动子的突变及对肝脏疾病进程的影响

肖九长，邹淑慧，唐金凤，刘 婷，范存琳，刘奕红，刘 聪

(赣州市人民医院，江西赣州341000)

赣州地区HBV Enh-I/X基因启动子的突变及对肝脏疾病进程的影响

肖九长，邹淑慧，唐金凤，刘 婷，范存琳，刘奕红，刘 聪

(赣州市人民医院，江西赣州341000)

目的通过对HBV Enh-I/X基因启动子序列的测定和比较，探讨其突变与肝脏疾病进展的关系。方法收集125份乙型肝炎感染者的血清标本HBV-DNA，PCR扩增HBV Enh-I/X基因并测序，比较不同患者之间的突变差异。结果获得HBV Enh-I/X基因42份，其中慢性乙型肝炎(CHB)20例，肝硬化（LC）14例，肝细胞癌（HCC）8例。突变率较高的位点有A1077C，A1123T和G1218C/A在CHB、LC及HCC组中的突变率分别为：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42. 9%和50%。对CHB、LC和HCC三组患者间进行比较，位点A1077C在LC组和HCC组的变异率为64.29%和50%，显著高于CHB组（20%，χ2=7.076，P=0.029）；位点A1123T在LC组和HCC组的变异率为50%和37.5%，显著高于CHB组（10%，χ2=7. 619，P=0.022）；位点A1317G在LC组和HCC组的变异率为35.71%和50%，显著高于CHB组（5%，χ2=8.019，P=0.018）。结论HBV Enh-I/X基因启动子序列上存在多位点的突变，可能影响转录水平及复制水平，使病情进展趋于复杂，了解其突变情况为乙型肝炎的治疗和控制疾病发展提供病毒学分子信息。

乙型肝炎病毒；Enh-I；突变

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染后可表现为乙肝携带者（AsC）、慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）甚至肝癌（HCC）[1，2]。HBV变异可影响慢性肝病的进展。HBV Enh-I/X基因启动子位于nt955-1359，是HBV基因组的顺式作用元件，包括调控区（nt955-1047），核心区（nt1048-1168）和X基因重叠区（nt1169-1359）[3]，可参与调控HBV基因组的转录与复制，其序列上的突变与HBV慢性感染的关联尚不明确。赣州地区作为乙型肝炎的高发区，对乙肝病毒基因组的突变与疾病的关系研究较少，本研究对HBV Enh I/X基因启动子进行序列分析，以探讨变异对肝脏疾病进程的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源研究对象：以2015年6月至2015年12月间在赣州市人民医院住院的慢性乙型肝炎患者为研究人群。共收集125份血清标本，男性82例，女性43例，年龄23~86岁，诊断标准符合2000年中华医学会修订的《病毒性肝炎防治方案》[4]，排除其他肝炎病毒（HAV、HCV、HDV、HEV）及CMV、HIV、EBV合并感染，无嗜酒史，无肝毒性药物使用史，无脂肪肝及自身免疫性肝炎，入选对象均未使用核苷类似物和干扰素等药物。所有患者HBV DNA均为阳性

1.2 HBsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb、HbcAb、PreS标志物采用中山生物工程有限公司试剂盒进行检测。1.3 HBV DNA的提取和定量提取液及Real time PCR试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。DNA的提取采用煮沸法（DNA提取液50μl加血清50μl，混匀后100℃水浴10min，12000r·min-1离心5min，上清备用)

1.4 HBV Enh I/X基因启动子的扩增和序列测定。PCR扩增及测序引物：F1：5’-ttgtctttgggtatacatttgaa -3’；R1：5’-ggcagcacagcctagcagcc-3’，由上海invitrogen生物科技有限公司合成。TransTaq DNA Polymerase High Fidelity(HiFi)试剂盒及DNA Marker购自北京Transgen生物科技有限公司。PCR反应条件：95℃，5min+94℃，45s+55℃，45s+ 72℃，90s)×35循环→72℃，10min。PCR产物交上海Invitrogen生物科技有限公司测序。采用GenBank中Genotyping软件对测序标本进行分型，所入选病例的基因分型已在前期工作完成。序列比对使用HBV B型(AF100309)为参照序列。利用ClustalX、Bioedit软件对产物序列进行基因的突变分析。1.5统计学方法计量资料采用均数±标准差（x± s）表示，计数资料采用例数和百分比表示，使用SPSS 13．0软件进行卡方检验，P<0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增及测序结果将125份HBsAg、HBV DNA均为阳性标本进行PCR扩增，部分标本因病毒载量较低，PCR反应产物太弱无法满足要求而未送测序。将扩增成功的PCR产物及相应的测序引物，委托Invitrogen生物科技有限公司进行DNA测序。获得42份靶序列。

2.2 测序标本的一般情况42份测序成功的标本包括20例CHB，14例LC和8例HCC。患者年龄、性别及HBV DNA水平见表1。

表1 测序标本的一般情况

2.3 HBVEnh I/X基因启动子的突变情况用GenBank中Genotyping对测序标本分析比对，发现所有标本均为B基因型。以标准株AF100309为参考序列，发现14个主要突变位点，其中调控区出现3个突变点：T960A、A987G、C1020T；核心区出现5个突变点：A1077C、A1080G、A1123T、C1135T和G1137A；X基因重叠区出现6个突变点：G1218C/A、A1221C、A1242C、A1317G、A1320C、G1347A。突变率较高的位点有A1077C，A1123T和G1218C/A在CHB、LC及HCC组中的突变率分别为：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42.9%和50%。对CHB、LC和HCC三组患者间进行比较时，发现HBV EnhI/X基因启动子出现了不同程度的变异。位点A1077C在LC组和HCC组的变异率为64.29%和50%，显著高于CHB组（20%，χ2=7.076，P=0.029）；位点A1123T在LC组和HCC组的变异率为50%和37.5%，显著高于CHB组（10%，χ2=7.619，P=0.022）；位点A1317G在LC组和HCC组的变异率为35.71%和50%，显著高于CHB组（5%，χ2=8.019，P=0.018），见表2。

3 讨论

我国是乙肝高发区。60%的人群被HBV感染过，10%的人群为HBsAg阳性携带者[5]。HBV感染是导致慢性肝脏疾病发生甚至HCC的最主要因素。HBV基因组是双链环状DNA，分结构基因和调节基因。目前已确定的开放读码框有PreS/S、PreC/ C、Pol以及X[6，7]。HBV调节序列由四个启动子（C、X、SPI、SPII）和两个增强子（EnhI、EnhII）组成。HBV Enh-I/X基因启动子位于955~1359之间，是HBV基因组中的顺式作用元件，包括调控区、核心区以及X基因启动子区[8]。位于S-ORP下游的Enh I，可调控基因表达，在转录和翻译过程中起重要作用，可与某些特定的细胞因子相结合，增加HbsAg、HbcAg和HbxAg的表达。研究表明Enh I的缺失可引起转录水平的下降[9]。HBV Enh-I/X基因启动子定位于P基因中，末端于X基因启动子重叠，该段基因能与核内转录因子相结合，提高各启动子的转录水平，上调前基因组RNA的表达进而增强病毒复制。HBV X蛋白可反式激活Enh I对全基因组或是亚基因组启动子控制下的转录，Enh I又增强了反式激活的易感性[10]。EnhI/X基因启动子在调节HBV复制和转录上发挥重要作用，其序列上某些位点的突变可引起增强子活性的改变，导致各启动子活性的下调，病毒载量的降低，使病毒复制能力下降而发生免疫逃逸，导致病毒难以清除，引起HBV感染慢性化。X基因启动子突变可增加HBxAg的表达，增加肝癌发生的机会[11]。

表2 CHB、LC和HCC患者间HBV Enh I/X基因启动子变异发生频数比较

本研究对125份标本进行扩增，最终获得HBV Enh-I/X基因42份。其中慢性乙型肝炎(CHB)20例，肝硬化（LC）14例，肝细胞癌（HCC）8例。以AF100309为参考序列，发现14个主要突变位点，突变率较高的位点有A1077C，A1123T和G1218C/ A在CHB、LC及HCC组中的突变率分别为：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42.9%和50%。然而某些位点（如G1218C/A）的突变率虽然很高，在CHB、LC和HCC三组间并无统计学差异。对CHB、LC和HCC三组患者间进行比较时，发现HBV Enh-I/X基因启动子出现了不同程度的变异。位点A1077C在LC组和HCC组的变异率为64.29%和50%，显著高于CHB组（20%，χ2=7.076，P=0.029）。有报道称肝细胞内的多种蛋白因子可与HBV EnhI核心区相互作用，调节HBV的复制和转录水平[12]。位于核心区的A1077C突变可能影响EnhI活性，降低病毒颗粒的分泌，造成病毒的免疫逃逸和持续性感染。位点A1123T在LC组和HCC组的变异率为50%和37.5%，显著高于CHB组（10%，χ2=7.619，P=0.022）。nt1123位点的变异可能影响其与HNF3转录因子的结合，降低Enh I活性，抑制HBV的基因表达与复制，从而逃避宿主免疫系统对病毒的清除，造成乙肝慢性化[13，14]。核心区其他突变A1080G、C1135T和G1137A在三组间无统计学意义。位点A1317G在LC组和HCC组的变异率为35.71%和50%，显著高于CHB组（5%，χ2= 8.019，P=0.018）。A1317G位于X基因重叠区，可以影响X启动子的活性，引起肝内炎症活动，加快疾病进程[15，16]。本研究变异位点与既往报道并不完全一致，可能因为不同地区所流行的基因型和亚型具有差异性，也可能与所选对象的肝炎症状、病毒载量等有关。有报道称G1053A和G1229A的变异是肝硬化患者发生HCC的高危因素[3]，但在本研究中并未发现这两个位点的突变，而本文发现位点A1077C在LC组和HCC组的变异率显著高于CHB组，此前尚未有过报道，其与肝癌发生的相关性是否在本地普遍流行还需进一步研究。

HBV的突变可影响转录水平及复制水平，往往使感染后的病情进展趋于复杂。对HBV Enh I/X基因启动子的突变及其与疾病进程的相关性进行研究，发现A1077C、A1123T和A1317G的位点突变或许可以作为CHB发展为肝硬化甚至肝细胞癌的预警信号，但仍需更大样本和更深入的纵向研究来确定Enh I/X基因启动子的突变在肝脏疾病进程中的作用。本研究的不足之处是未检测出C基因型，不同基因型是否影响疾病发展尚需扩大样本进一步研究。

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R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2016)06-0728-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.06.010

2016-07-25；

2016-11-23)

赣州市科技局指导性计划课题，编号：GZ2015ZSF109

肖九长，1969年9月生，学士学位，副主任技师，研究方向为生物化学、肿瘤免疫及分子生物学。Email：18007079870@126. com

邹淑慧，1988年11月生，硕士学位，检验技师，研究方向为病原生物学。E-mail：364235529@qq.com