程氏蠲痹汤加减方含药血清对佐剂性关节炎大鼠外周血单核细胞TNF-α和IL-1β表达的影响

许 霞，杜 欢，程 卉，孟庆威，吴亚兰，郭梦园

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)



程氏蠲痹汤加减方含药血清对佐剂性关节炎大鼠外周血单核细胞TNF-α和IL-1β表达的影响

许 霞，杜 欢，程 卉，孟庆威，吴亚兰，郭梦园

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

目的 探讨程氏蠲痹汤加减方含药血清对体外培养的佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠外周血单核细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)表达的影响。方法 将清洁级雄性SD大鼠随机分成6组：胎牛血清组、程氏蠲痹汤加减方(JBT)组、雷公藤多苷片(TGT)组、JBT+sc-13143组、正常大鼠血清组以及阴性对照组。采用皮内注射弗氏完全佐剂和冷水吹风刺激的方法复制风寒湿痹阻型AA模型。检测各组大鼠血清培养基中外周血单核细胞TNF-α和IL-1β的表达水平。结果 JBT组大鼠外周血单核细胞TNF-α和IL-1β表达水平明显降低，与胎牛血清组、正常大鼠血清组以及阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。JBT+sc-13143组与JBT组TNF-α、IL-1β表达水平相比，差异也有统计学意义(P<0.05)。结论 程氏蠲痹汤加减方能有效下调AA大鼠外周血单核细胞TNF-α和IL-1β水平。

类风湿关节炎；程氏蠲痹汤；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种临床比较常见的结缔组织炎症，以关节滑膜为主要靶组织的慢性、系统性、炎症性自身免疫性疾病，临床多见关节和肌肉酸楚、重着、疼痛。RA主要发病于手足中小关节，疾病迁延难愈，降低患者的生活质量，且具有较高的致残率。目前尚无针对本病的特效药或效果满意的药物。中医采用辨证论治的方法治疗RA，具有疗效较好、毒性及不良反应较小的优势，因而获得了国内外医学界的普遍关注，并进行了大量的实验和临床研究。

程氏蠲痹汤是新安医家程钟龄的自创方，原方名为蠲痹汤，出自于《医学心悟》，冠以“程氏”二字以与其他蠲痹汤相区分。该方是程钟龄临床治疗风寒湿型痹病的通治方，其主要功效是祛风散寒、除湿通络。在程氏医案中多有效验，后世医家治痹医案中也常见该方的加减使用，直至现代仍有医家使用程氏蠲痹汤的临床报道[1-4]。但其治疗RA的机制研究尚未见报道。本研究在前期体内研究的基础上，观察了程氏蠲痹汤加减方(Juanbi Tang,JBT)含药血清对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠外周血单核细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)的影响，现报道如下。

1 材料

1.1 动物 取清洁级雄性SD大鼠20只，平均体质量(200±20)g，由安徽长临河医药科技有限公司提供，生产许可证号为SCXK(皖)2011-002。实验前在室温22～28 ℃、相对湿度50%～60%的环境下随机分笼饲养3 d，自然光照周期。观察未出现异常者方可入组进行实验。

1.2 药品和试剂 JBT(羌活、独活、桂枝、白芍、秦艽、川芎、黄芪、海风藤、桑枝、乳香、木香等)：饮片均由安徽中医药大学门诊部提供，水煎2次，合并煎液，浓缩至2 g/mL的药液；雷公藤多苷片(tripterygium glycosides tablet，TGT)(批号 130902，每片10 mg)：上海复旦复华药业有限公司；弗氏完全佐剂：美国Sigma公司；RPMI 1640培养液(批号 1627680)、胎牛血清(批号 1414426)：Gibco产品；大鼠TNF-α ELISA试剂盒(批号 CK-E30635R)、大鼠IL-1β ELISA试剂盒(批号 CK-E30419R)：上海源叶生物技术有限公司；sc-13143(批号 F2812)：Santa Cruz生物科技公司。

1.3 仪器 Beckman Allegra 64R高速冷冻离心机：美国贝克曼公司；MCO-175 CO2培养箱：日本三洋电气集团；Spectra Max M2e多功能酶标仪：美国Molecular Devices公司；XB-20雪花制冰机：浙江省宁波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q超纯水机：美国密理博公司。

2 方法

2.1 实验方法

2.1.1 风寒湿痹阻型AA模型复制 除正常大鼠血清组外，向每只大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL致炎，复制AA大鼠模型。模型复制第1天，除正常大鼠血清组外，其余大鼠置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，站立其中20 min，同时伴以3～4级风力，每日1次，连续14 d，复制风寒湿证模型。以上两者结合，复制病证结合模型。

2.1.2 T细胞分离培养 结合关节肿胀度和关节炎指数，选择模型复制成功大鼠，腹腔注射予其麻醉，在超净台中，共采集大鼠腹主动脉血60 mL备用。将大鼠的新鲜抗凝血分别倒入两支50 mL的一次性刻度离心管，每只30 mL，加PBS稀释。在新的小口径15 mL刻度离心管内加入5 mL淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque Plus)，用吸管将10 mL稀释血液沿管壁缓慢加到分离液上。2 000 r/min，15 min室温离心。取中间云雾状白膜层细胞，置于另一离心管中，加入5倍的PBS重悬。然后1 500 r/min离心10 min，迅速倒出上清液，轻弹管底沉淀细胞团块使其松散。加入6～10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解5 min。1 500 r/min 离心5 min，弃上清。洗涤细胞2次，免疫磁珠标记并分选获得目的细胞，即潘氏T细胞。补入2 mL PBS，计数并用流式细胞仪检查细胞纯度。5% CO2、37 ℃培养箱内培养，30%湿度，20 mL一次性培养瓶进行细胞培养。1 000 r/min离心5 min，去上清，沉淀，加新培养液后再混匀传代。

2.1.3 动物血清制备 取清洁级雄性SD大鼠，平均体质量(200±20)g。JBT组大鼠被灌服JBT药液9 mL/kg(为60 kg成人临床用药量8倍)，每日1次。TGT组大鼠被灌服TGT混悬液(将TGT研成细末，加生理盐水制成0.57 mg/mL混悬液)10 mL/kg，每日1次。均连续给药7 d，于第7 d用药4 h后麻醉，无菌条件下股动脉取血，分离血清。56 ℃灭活30 min，滤过，除菌。-20 ℃保存备用。另设阴性对照组，取空白血清，予等量生理盐水灌胃，其余方法同上。

2.1.4 分组方法 按培养基中所含血清成分的不同分成6组。①胎牛血清组：培养基中含10%胎牛血清；②JBT组：培养基中含10% JBT大鼠药物血清；③TGT组：培养基中含10% TGT大鼠药物血清；④JBT+sc-13143组：培养基中除含10% JBT药物血清之外，还含有G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)阻滞剂sc-13143，浓度按1∶50加入培养液；⑤正常大鼠血清组：培养基中含10%正常大鼠血清；⑥阴性对照组：不加大鼠血清，培养基中含10%生理盐水。

3 结果

3.1 JBT含药血清对AA大鼠体外单核细胞TNF-α表达的影响 JBT组及TGT组大鼠外周血单核细胞TNF-α表达水平明显降低，与胎牛血清组、正常大鼠血清组和阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。JBT+sc-13143组与JBT组相比，差异也有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 JBT含药血清对AA大鼠体外单核细胞TNF-α表达的影响

注：与胎牛血清组比较，*P<0.05；与JBT组比较，#P<0.05。

3.2 JBT含药血清对AA大鼠体外单核细胞IL-1β表达的影响 JBT组大鼠外周血单核细胞IL-1β表达水平明显降低，与胎牛血清组、正常大鼠血清组和阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。JBT+sc-13143组与JBT组相比，差异也有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 JBT含药血清对AA大鼠体外单核细胞IL-1β表达的影响

注：与胎牛血清组比较，*P<0.05；与JBT组比较，#P<0.05。

4 讨论

程氏蠲痹汤是新安医家程钟龄的自创方，是后世中医界治疗痹病的常用方。JBT由程氏蠲痹汤加减而成。方中君药由羌活、独活二者组成，祛风除湿，通利关节，祛除一身之风寒湿邪。以桑枝、海风藤通利关节为臣药，体现了“通”在痹病治疗中重要性。辅佐以白芍、桂枝、川芎、秦艽、乳香、木香等行气活血化瘀、止痛以蠲痹，体现“治风先治血，血行风自灭”之意。方中再配以黄芪，体现气血同治。全方诸药合用，祛风散寒、除湿通络止痛以治标，补气行气活血以治本。

由类风湿性滑膜中巨噬细胞、纤维母细胞或滑液中的中性白细胞生成的炎性因子TNF-α和IL-1β在RA病情进程中有着重要的作用。TNF-α和IL-1β在活动性RA中主要参与刺激多形核细胞和结缔组织细胞，产生前列腺素等小分子炎性递质；激活血管内皮细胞，增强内皮细胞黏附分子的表达，在关节炎时，正是通过与黏附分子的互相作用，使血液中白细胞被汇集到关节腔内；通过刺激骨膜细胞和破骨细胞、软骨细胞，使糖蛋白的合成减少、降解增加，同时产生释放骨钙的胶原酶和其他中性蛋白酶，从而导致骨和软骨破坏[5]。TNF-α是一种诱导炎症发生的关键因子，是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与正常炎性反应和免疫反应[6]。TNF-α在RA的发生发展过程中是个强有力的促炎因子，发挥着重要作用，能刺激IL-1、IL-6、IL-8的产生，并激活地诺前列酮和胶原酶，引起血管生成；TNF-α与转化生长因子可产生协同效应，诱导血管生成。IL-1β主要也是由活化的单核-巨噬细胞分泌产生，多项研究发现RA患者的血清及关节液中可检测到IL-1β，相关研究显示IL-1β主要与RA患者的软骨损伤有关，也是RA炎症发生过程中重要的细胞因子，可刺激T细胞和B细胞产生各种细胞因子和抗体[7]。IL-1家族中IL-1α、IL-1β作为致炎性激动剂，IL-1Rα作为抑制前者的受体拮抗剂，其作用机制已被广泛研究。IL-1β占主要致炎地位，它通过激活单核-巨噬细胞、B细胞和T细胞释放细胞因子和抗体，同时在促进破骨细胞分化方面起着重要作用。同时有研究表明，TNF-α能够诱导IL-1和IL-6的分泌增加。因此，当IL-1和TNF-α水平表达高时，会刺激软骨细胞和滑膜细胞产生胶原酶和基质金属酶等，同时激活破骨细胞，导致滑膜炎症、骨溶解和软骨的吸收破坏[5]。大量实验和文献证实，IL-1β、IL-6及TNF-α在RA的炎症过程中至关重要。RA疾病的发生是由相互依赖的细胞因子网络调节的[8]。

G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupled receptors kinases，GRKs)是一簇与G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)快速失敏相关的激酶，是GPCRs信号通路的调控蛋白。已经发现GRKs与炎性反应的发生密切相关，在免疫细胞调节中起重要作用。免疫细胞中GRKs的表达水平随着炎症的发展是动态变化的[9]。现代研究还发现，RA大鼠T淋巴细胞G蛋白信号转导通路及其调控蛋白发生了异常改变[10]。表明G蛋白偶联信号通路是影响T细胞功能的重要信号通路。

本研究结果显示，JBT含药血清可显著降低大鼠外周血单核细胞TNF-α和IL-1β表达水平，效果优于TGT含药血清，两组均与胎牛血清组、正常大鼠血清组以及不加血清的阴性对照组有显著差异。同时，在实验中加入了GRK2信号通路的阻滞剂sc-13143，以探讨JBT可能的作用机制，为进一步的实验做准备，本研究也证实了JBT+sc-13143组与JBT组相比有显著差异(P<0.05)。说明GRK2信号通路可能是JBT治疗RA的机制之一。

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Effect of Modified Cheng’s Juanbi Decoction-containing Serum on Expression of Tumor Necrosis Factor-α and Interleukin-1β in Peripheral Blood Mononuclear Cells in Rats with Adjuvant Arthritis

XU Xia, DU Huan, CHENG Hui, MENG Qing-wei, WU Ya-lan, GUO Meng-yuan

(Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Hefei 230012, China)

Objective To investigate the effect of modified Cheng’s Juanbi Decoction-containing serum on the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in peripheral blood mononuclear cells culturedinvitroin rats with adjuvant arthritis (AA). Methods Clean male Sprague-Dawley rats were randomly divided into fetal bovine serum group, modified Cheng’s Juanbi Decoction (JBT) group, tripterygium glycoside tablet (TGT) group, JBT+sc-13143 group, normal rat serum group, and negative control group. A model of cold-damp obstruction-type AA was established by intradermal injection of Freund’s complete adjuvant and stimulation with cold water and wind. The expression of TNF-α and IL-1β in peripheral blood mononuclear cells in rats was measured. Results The JBT group had significant reductions in the expression of TNF-α and IL-1β in peripheral blood mononuclear cells compared with the fetal bovine serum group, the normal rat group, and the negative control group (P<0.05). There were significant differences in the expression of TNF-α and IL-1β between the JBT+sc-13143 group and the JBT group (P<0.05). Conclusion Modified Cheng’s Juanbi Decoction can effectively downregulate the expression of TNF-α and IL-1β in peripheral blood mononuclear cells in rats with AA.

Rheumatoid arthritis; Cheng’s Juanbi Decoction; Tumor necrosis factor-α; Interleukin-1β

国家自然科学基金青年项目(81302911)；高校省级优秀青年人才基金重点项目(2013SQRL040ZD)；安徽中医药大学自然科学研究项目(2013qn015)

许霞(1979-)，女，博士，副教授

R593.22；R285.5

10.3969/j.issn.2095-7246.2016.06.022

2016-06-18；编辑：姚实林)