5种肿瘤干细胞标志物在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

蔡传书 王培荣 黄 雄 吕文龙

(福建医科大学附属第一医院放疗科，福建 福州 350005)



5种肿瘤干细胞标志物在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

蔡传书 王培荣 黄 雄 吕文龙

(福建医科大学附属第一医院放疗科，福建 福州 350005)

目的 探讨CD133、滋养层细胞表面抗原-2(TROP-2)、CD44、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)及神经营养因子受体p75(p75NTR)五种肿瘤干细胞(CSC)标志物在非小细胞肺癌(NSCIC)组织中的表达及其与临床病理参数间的关系。方法 选取80例NSCLC组织、33例癌旁组织、28例正常组织为研究对象，采用免疫组化法检测各组织中CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR蛋白表达的差异，分析其与NSCLC患者病理参数的相关性。结果 (1)CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在NSCLC组织中的阳性率分别为80.00%、87.50%、50.00%、62.50%、68.75%；在癌旁组织中的阳性率分别为6.06%、30.30%、15.15%、21.21%、12.12%；在正常组织中的阳性率分别为46.43%、10.71%、21.43%、21.43%、21.43%，各指标在不同组织间的阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)随着细胞分化程度的降低，NSCLC组织中的CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的阳性率均呈上升趋势(P<0.05)，CD133、TROP-2阳性率与NSCIC患者年龄、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05)，ABCG2及p75NTR阳性率与NSCIC患者年龄及远处转移有关(P<0.05)。结论 NSCLC组织中CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的表达水平异常，且均与NSCLC肿瘤细胞分化密切相关。

非小细胞肺癌；肿瘤干细胞

肿瘤干细胞(CSC)是肿瘤组织中具有自我更新、增殖以及多向分化的肿瘤细胞，也是肿瘤不断生长、转移与复发根源〔1〕。CD133是一种经典的CSC标志物〔2，3〕，众多研究表明，滋养层细胞表面抗原-2(TROP-2)、CD44、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)及神经营养因子受体p75(p75NTR)等也具有CSC特性，可以作为CSC筛选标志物，与肿瘤生长、转移、侵袭息息相关〔4，5〕。本研究采用免疫组化法检测CSC标记物CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在非小细胞肺癌(NSCLC)、癌旁及正常组织中的表达情况，分析其与临床病理参数的相关性。

1 资料和方法

1.1 临床资料 抽选2010年3月至2015年7月在我院行手术切除术的80例NSCLC患者，留取手术组织标本存档。纳入标准：①临床上均经组织学检查，确诊为NSCLC；②患者术前均未予以放、化疗治疗或者其他抑制肿瘤治疗，排除其他类型肺癌患者。男30例，女50例，年龄44～73岁，平均(62.8±8.6)岁。取33例癌旁组织、28例正常组织进行检测，其中癌旁组织男12例，女21例，年龄48～77岁，平均(63.8±9.1)岁。正常组织：其中男10例，女18例，年龄45～75岁，平均(62.9±8.9)岁。三组性别、年龄资料比较均无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试剂 CD133多克隆抗体购自英国Abcam公司。ABCG2、p75NTR、EnVisionTM检测试剂盒购自Gene Tech公司，CD44兔抗人抗体购自武汉博士德公司，羊抗人TROP-2多抗购自美国R&D公司，DAB显色剂(DAB003)购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 免疫组织化学染色法 所有组织标本经10%甲醛固定，石蜡包埋组织，连续切片，厚度4 μm，利用二甲苯和乙醇脱蜡水化等处理。切片入pH6.0柠檬酸缓冲液进行冲洗，高温、高压抗原修复。自来水冲洗冷却至室温后，采用PBS进行液洗3次，5 min/次。用3% H2O2滴加至切片上，室温孵育30 min，继而PBS洗涤3次，5 min/次。甩去PBS液，每张切片上滴加50 μl稀释后的CD133多克隆抗体、ABCG2、p75NTR、CD44兔抗人抗体、羊抗人TROP-2多抗；湿盒内孵育1 h，PBS洗涤3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加EnVisionTM试剂盒试剂1，室温孵20 min，继而PBS洗涤3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加EnVisionTM试剂盒试剂2，室温孵育30 min，继而PBS 洗涤3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加DAB 显色液，封片，显微镜下观察，用PBS磷酸缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 阳性结果判断标准 由2名病理医生在对标本资料不知情的情况下独立完成。标准：DAB阳性染色为棕色或黄色，计数4个不重叠的高倍视野下大约200个癌细胞，阳性细胞数>10%为阳性，≤10%为阴性。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件，计量资料组间采用t检验，计数资料采用χ2检验。

2 结 果

2.1 5种CSC标志物在NSCIC、癌旁组织、正常组织中的表达 CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在NSCLC组织中的阳性率分别为80.00%、87.50%、50.00%、62.50%、68.75%；在癌旁组织中的阳性率分别为6.06%、30.30%、15.15%、21.21%、12.12%；在正常组织中的阳性率分别为46.43%、10.71%、21.43%、21.43%、21.43%，各指标在不同组织间的阳性率比较均有统计学差异(P<0.05)。

2.2 5种CSC标志物表达与NSCIC病理参数的关系 见表1。随着细胞分化程度的降低，NSCLC组织中的CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的阳性率均呈上升趋势(P<0.05)；此外，CD133、TROP-2阳性率与NSCIC患者年龄、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05)，ABCG2及p75NTR阳性率与NSCIC患者年龄及远处转移有关(P<0.05)。

表1 5种CSC标志物表达与NSCIC病理参数的关系〔n(%)〕

临床病理参数nCD133(n=64)阳性率 P值CD44(n=70)阳性率 P值TROP-2(n=40)阳性率 P值ABCG2(n=50)阳性率 P值p75NTR(n=55)阳性率 P值年龄(岁)<653621(58.33)<0.0527(75.00)>0.0513(36.11)<0.0517(47.22)<0.0519(52.78)<0.05≥654443(97.73)43(97.72)27(61.36)33(75.00)36(81.82)性别男3024(80.00)>0.0529(96.67)>0.0516(53.33)>0.0520(66.67)>0.0520(66.67)>0.05女5040(80.00)41(82.00)24(48.00)30(60.00)35(70.00)吸烟指数<4004534(75.56)>0.0540(88.89)>0.0522(48.89)>0.0530(66.67)>0.0530(66.67)>0.05≥4003530(85.71)30(85.71)18(51.43)20(57.14)25(71.43)远处转移有1612(75.00)>0.0515(93.75)>0.058(50.00)>0.0515(93.75)<0.0515(93.75)<0.05无6452(81.25)55(85.94)32(50.00)35(54.69)40(62.50)淋巴结转移有3028(93.33)<0.0528(93.33)>0.0523(76.67)<0.0520(66.67)>0.0522(73.33)>0.05无5036(72.00)42(84.00)17(34.00)30(60.00)33(66.00)TNM分期Ⅰ3625(69.44)<0.0531(86.11)>0.0510(27.78)<0.0520(55.56)>0.0527(75.00)>0.05Ⅱ1915(78.95)17(89.47)10(52.63)13(68.42)13(68.42)Ⅲ2524(96.00)22(88.00)20(80.00)17(68.00)15(60.00)肿瘤长径<3cm4534(75.56)>0.0541(91.11)>0.0523(51.11)>0.0529(64.44)>0.0530(66.67)>0.05≥3cm3530(85.71)29(82.86)17(48.57)21(60.00)25(71.43)细胞分化高分化2717(62.96)<0.0521(77.78)<0.059(33.33)<0.0513(48.15)<0.0513(48.15)<0.05中分化4035(87.50)36(90.00)20(50.00)24(60.00)29(72.50)低分化1312(92.31)13(100.00)11(84.62)13(100.00)13(100.00)病理类型鳞癌3529(82.86)>0.0532(91.43)>0.0520(57.14)>0.0522(62.86)>0.0526(74.29)>0.05腺癌2519(76.00)21(84.00)11(44.00)18(72.00)18(72.00)肺泡细胞癌1512(80.00)13(86.67)9(60.00)10(66.67)11(73.33)大细胞未分化54(80.00)4(80.00)000

3 讨 论

现代肿瘤手术、放化疗、生物治疗技术均在不断进步，但随着放化疗抵抗的发生，NSCLC等肿瘤患者的术后复发率、临床死亡率仍居高不下〔6，7〕，故寻找NSCLC治疗的新靶点，对患者个体化治疗及预后具有重要临床价值。近年研究发现，靶向CSC是根治肿瘤的一个临床新方向〔8〕，CSC是肿瘤细胞中的特殊细胞，具有极强的自我更新、分化能力，发挥多种功能；此外，CSC具有较强迁徙以及运动能力，可促进细胞转移，引发肿瘤浸润和转移等〔9，10〕，另外，CSC还可长期维持正常机体的相对稳定休眠状态，有较强的耐药性。有研究认为〔11〕，CSC是肿瘤发生、发展及复发的源泉，肿瘤生长以及分化最终取决于其组织中CSC表达，同时肿瘤本身具有转移潜力，当机体CSC表达达到一定程度时，肿瘤的转移将不可避免。研究人员近年来相继在胶质瘤、结肠癌、乳腺癌、肝癌等中发现CSC表达〔12〕，而NSCLC组织中的CSC表达及作用机制一直存在较大争议。研究发现，肺组织中存在细支气管肺泡干细胞(BASCs)，这为CSC对肺癌的发病作用提供了实验依据〔13〕。

CD133是Prominin 家族成员，存在于外周血、骨髓、脐带血及其他组织中〔14〕，CD133+对肿瘤增殖、分化、复发有着关键作用〔15，16〕。有研究发现，CD133+表达与肿瘤预后相关，高水平的CD133结直肠癌病人预后较差〔17〕。本研究提示CD133在NSCLC组织中异常高表达，同时肿瘤细胞分化程度越低、TNM分期越高，存在淋巴结转移患者中的阳性表达率越高，这说明CD133阳性表达参与了NSCLC肿瘤干细胞的增殖、分化及转移等过程。

CD44是一种广泛存在于表皮细胞与间皮细胞中的黏附分子，主要参与异质性黏附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的黏附，异质性黏附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用，与恶性肿瘤发生发展密切相关〔18〕。国外文献报道，CD44在前列腺癌组织中表达升高，与癌细胞生长存在相关性〔19〕。国内有研究〔20〕报道，CD44在NSCLC组织中的阳性率为65.33%，明显高于正常肺组织的20.00%且CD44过量表达患者的生存率低于正常水平者。本研究与上述研究结果一致，进一步证实CD44的异常表达与NSCLC的发病有关。此外，本研究中CD44阳性表达率随着肿瘤细胞分化程度的降低而呈上升趋势，提示CD44阳性表达影响着NSCLC的发生、发展。

TROP-2是一种跨膜糖蛋白，在正常人体合包体滋养层、细胞滋养层及复层上皮细胞均存在表达，具有调节肿瘤细胞生长、侵袭以及转移的作用。近年来，已证实TROP-2在鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等许多实体瘤中表达水平增高〔21〕。本文结果也说明TROP-2与NSCLC的发生、发展有关。

ABCG2是一种转运蛋白，在维持细胞自身稳定及机体正常生理功能等方面起着重要作用，主要定位于细胞膜上，正常生理下可保护机体，而对肿瘤而后则可导致其耐药。研究发现，三磷酸腺苷结合盒转运体(ABC)仅在干细胞上表达，具有分化调节干细胞作用〔22〕。p75NTR是肿瘤坏死因子受体成员，主要在神经细胞的早期发育过程中大量表达，通过不同的信号转导通路诱导以神经细胞为主的细胞增殖、迁移、分化、生存、凋亡、突触的建立和神经的形成,发挥多重生物学效应。早期认为p75NTR仅参与神经细胞发育早期的增殖、迁移、凋亡，近年来研究发现，p75NTR阳性细胞自我更新、增殖及多向分化能力较强，证实为食管上皮CSC〔23〕。本研究结果显示，ABCG2及p75NTR的表达在肿瘤发生、发展过程中可能发挥作用，但其相关性仍需加大样本量分析。

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〔2016-07-15修回〕

(编辑 郭 菁)

蔡传书(1965-)，男，主任医师，主要从事肿瘤诊断与放射治疗方面的研究。

R73

A

1005-9202(2016)23-5905-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.058