阿托伐他汀对血管紧张素Ⅱ诱导的心房肌细胞结缔组织生长因子及缝隙连接蛋白43表达的影响

雷光涛 何力鹏 黄铁球 吴延庆 吴清华 程晓曙 姜 宇

(南昌大学第二附属医院心血管内科，江西 南昌 330006)



阿托伐他汀对血管紧张素Ⅱ诱导的心房肌细胞结缔组织生长因子及缝隙连接蛋白43表达的影响

雷光涛 何力鹏1黄铁球 吴延庆 吴清华 程晓曙 姜 宇

(南昌大学第二附属医院心血管内科，江西 南昌 330006)

目的 探讨阿托伐他汀对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心房肌细胞结缔组织生长因子(CTGF)和缝隙连接蛋白(Cx43)表达的影响。方法 将雄性Wistar大鼠40只随机分为A组(15只，给予0.9%氯化钠溶液)、B组(12只，给予盐酸异丙肾上腺素)和C组(13只，给予盐酸异丙基肾上腺素+阿托伐他汀钙片)。分别用放射免疫法测定AngⅡ浓度，凝胶成像系统分析转化生长因子(TGF)-β mRNA、CTGF和Cx43 mRNA的表达。结果 三组大鼠血浆和心肌AngⅡ水平均有统计学差异(P<0.05)，B组大鼠血浆和心肌AngⅡ水平均高于A组(P<0.05)，C组与A组无统计学差异(P>0.05)。三组大鼠TGF-β1 mRNA、CTGF和Cx43 mRNA表达水平均有统计学差异(P<0.05)，B组大鼠TGF-β1 mRNA、CTGF和Cx43 mRNA表达水平均高于A组(P<0.05)，C组与A组无统计学差异(P>0.05)。结论 阿托伐他汀能够降低AngⅡ诱导的心房肌细胞CTGF和Cx43 mRNA表达，减轻与CTGF和Cx43 mRNA表达相关的心肌纤维化和心脏重构进展，在房颤的预防和治疗中具有一定的临床意义。

血管紧张素Ⅱ；结缔组织生长因子；缝隙连接蛋白43；阿托伐他汀

阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化、降脂、抑制细胞外基质(ECM)聚集等作用，已在心血管病的治疗中广泛应用〔1〕。结缔组织生长因子(CTGF)能够加快多种活细胞的分裂增殖、上调ECM含量、促进组织纤维化，参与皮肤再生、肿瘤细胞分化、瘢痕形成、器官纤维化、肌肉代谢等多个病理生理和代谢过程〔2〕。心房肌细胞缝隙连接蛋白(Cx)43能够影响细胞冲动传导，进而影响心脏电生理，促进心房重构〔3〕。研究发现，血管紧张素(Ang)Ⅱ能够通过Rao蛋白系统上调CTGF和Cx43的表达，而阿托伐他汀能够通过抑制AngⅡ表达影响CTGF和Cx43的表达〔4〕。本实验拟探讨阿托伐他汀对CTGF和Cx43表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 雄性Wistar大鼠40只，体重40～45 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。多克隆抗体、单克隆抗体β-actin均购自美国Santa Cruz生物科技公司；DMEM干粉培养基、胰蛋白酶、牛血清、Ⅱ型胶原酶均购自美国Gibco公司；免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥公司；总RNA提取试剂盒和PCR试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 诱导分组 使用计算机随机数生成器将40只大鼠分为三组。A组(15只)：给予0.9%氯化钠溶液；B组(12只)：给予盐酸异丙肾上腺素(华润双鹤药业股份有限公司，批准文号：国药准字H11021929)；C组(13只)：给予盐酸异丙肾上腺素+阿托伐他汀钙片(北京嘉林药业股份有限公司；批准文号：国药准字H20093819)。

1.3 心房肌细胞培养 大鼠仰卧位固定，打开胸腔，取胸壁组织去血、冷磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，将心房肌剪成肌粒。加入胰酶(浓度为0.08%)、常温水浴10 min。加入混合酶水浴消化，收集上清液，添加DMEM/F12终止消化、洗细胞、制作单细胞悬液，接种于培养皿培养。

1.4 免疫组织染色 培养细胞1 d后，使用多聚甲醛(4%)固定30 min，在H2O2(30%)1份+纯甲醇50份混合液浸泡、灭活，蒸馏水洗涤。牛血清白蛋白(BSA)封闭液，去除多余液体。滴加兔抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白一抗工作液，PBS液清洗。添加羊抗兔二抗，20 min，PBS液清洗。二氨基联苯胺(DAB)常温显色，脱水、透明后封片。

1.5 AngⅡ测定 在液氮中研磨心房肌组织，加入PBS液(0.05 mol/L，pH7.4)5 ml、二巯基丙醇(0.32 mol/L)10 μl、8-羟基喹啉硫酸盐(0.34 mol/L)20 μl，离心(2 000 r/min)10 min取上清液。采用放射免疫法测定血浆和心肌AngⅡ水平。

1.6 转化生长因子(TGF)-β1、CTGF和Cx43测定 采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，依据试剂盒说明进行逆转录反应。以各自引物扩增TGF-β1、CTGF和Cx43，引物见表1。扩增条件：95℃预变性5 min，然后95℃45 s，55℃1 min，72℃1 min，循环40次，72℃8 min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统分析mRNA表达水平。

表1 各基因引物序列及扩增片段长度

基因引物序列片段长度TGF-β1正义链:5'-AGGTAACGCCAGGAATTGTTGCTA-3'反义链:5'-TGCGCCTGCAGAGATTCAAG-3'79bpCTGF正义链:5'-CCTGACCCAACTATGATGC-3'反义链:5'-CCCTTACTCCCTGGCTTT-3'200bpCx43正义链:5'-AGAATCATAGCGTCGGTGTCAGG-3'反义链:5'-GCTGGTATTTGGATGGCTGAAGA-3'82bp

1.7 统计学方法 应用SPSS16.0软件，定量资料多组间差异性分析采用方差分析，多组间的两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组大鼠AngⅡ水平比较 三组大鼠血浆和心肌AngⅡ水平均有统计学差异(P<0.05)。B组大鼠血浆和心肌AngⅡ水平均高于A组(P<0.05)，C组与A组无统计学差异(P>0.05)。见表2。

组别n血浆心肌A组15503.65±9.5760.41±1.37B组12517.73±8.571)61.6±1.051)C组13506.77±14.8960.9±0.06F/P值-5.860/0.0064.566/0.017

与A组比较:1)P<0.05；下表同

2.2 三组大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表达水平比较 三组大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表达水平均有统计学差异(P<0.05)。B组大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表达水平均高于A组(P<0.05)，C组与A组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组别nTGF-β1CTGFCx43A组150.28±0.060.42±0.030.95±0.05B组120.38±0.071)0.47±0.041)1.01±0.061)C组130.31±0.080.44±0.050.95±0.03F/P值-6.920/0.0034.697/0.0154.870/0.013

3 讨 论

CTGF基因位于6q23.1，在人体众多组织器官中广泛表达。CTGF的表达受多种细胞因子的调控，如AngⅡ、血管内皮生长因子、TGF-β、胰岛素样生长因子-1、糖基化终产物等，以及机械应力、静水压和氧化应激等均能刺激CTGF〔5〕。作为GTGF的上游因子，二聚多肽类生长因子TGF-β1具有多种生物学效应，在组织纤维化过程中发挥重要作用。TGF-β1是CTGF调控最重要的通路，通过Smad信号通路、Ras/MEK/ERK1/2通路诱导CTGF的表达〔6〕。CTGF通过和多种生长因子结合发挥不同的生物学效应〔7〕：(1)生长与分化：CTGF能够上调cAMP水平，加速细胞分裂和增殖；(2)细胞黏附与趋化：CTGF通过结合ECM促进细胞黏附，具有促进成纤维细胞向纤连蛋白黏附的作用；(3)细胞凋亡：CTGF能够增强caspase23活性，降低平滑肌细胞活性，促进细胞凋亡；(4)平衡ECM稳态：CTGF能够促进层黏蛋白、糖蛋白胶原的生成，诱导胶原表达，抑制ECM降解酶的活性，促进纤维化；(5)促血管生成。相关研究发现〔8〕，敲除CTGF基因的小鼠表现出血管缺陷，表明CTGF是促血管形成因子。Cx蛋白以端端连接的方式分布在心房肌细胞中，与心脏电激动传导各向异性和方向密切相关。心肌间质纤维化会影响缝隙连接的大小、数量和分布，进而影响细胞间的传导作用。细胞外调节激酶、钙调神经磷酸酶、钙网蛋白、AngⅡ、TGF-β1等信号传导因子构成的信号网络均能够调节Cx43的磷酸化，影响Cx43装配、含量、分布与传导，影响缝隙连接重构。

研究发现，他汀类药物除了具有调脂功效外，还能抑制氧化反应、抑制炎症反应、减少组织胶原含量、提高内皮细胞功能、促进斑块稳定等〔9〕。临床研究和动物实验均表明〔10〕，他汀类药物能够改善心肌的纤维化和心室重构。Riser等〔11〕研究发现，他汀类药物能够降低CTGF表达，减轻肾间质的纤维病变。Abraham等〔12〕在对肥厚性心肌病白兔研究中发现，他汀类药物能够减轻心肌肥厚和心肌纤维化。Rakotoniaina等〔13〕研究发现，阿托伐他汀能够改善心脏供血、减缓心室重构。他汀类能够抑制AngⅡ的表达、降低ACE活性，减少NO生成，保护心房肌细胞，改变缝隙连接重构。

本研究结果发现，大鼠血浆和心肌AngⅡ水平先增高，使用阿托伐他汀后下降，基本恢复到对照组水平，说明阿托伐他汀能够降低血浆和心肌AngⅡ水平。其可能机制是：阿托伐他汀通过抑制异戊烯化进程，阻止小分子单体G蛋白激活，进而降低AngⅡ受体表达〔14〕。TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表达水平改变与AngⅡ受体表达水平趋势一致，AngⅡ受体表达较高者TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表达也相对较高。其可能机制如下：AngⅡ通过激活TGF-β1生物活性途径或Rao蛋白系统途径增加CTGF表达，介导心肌纤维化。 随着AngⅡ水平升高，有丝分裂原活化蛋白激酶信号分子(如JNK、P38、ERK等)使得Cx43肽链发生多位点磷酸化，Cx43合成增加；AngⅡ增加促进Ca2+内流，激活蛋白酶Calpains和钙调神经磷酸酶、释放溶酶体、破坏细胞亚结构，增加Cx43的降解，最终使得Cx43合成减少〔15〕。阿托伐他汀能够降低AngⅡ诱导的TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表达。

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〔2015-12-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

2014年省级第二批科技专项项目(No.20142BAB205042)

1 江西省武警总队医院心内科

姜 宇(1975-)，男，硕士，副主任医师，主要从事动脉粥样硬化病变、冠心病介入治疗方面的研究。

雷光涛(1984-)，男，硕士，主治医师，主要从事动脉粥样硬化病变方面的研究。

R54

A

1005-9202(2016)23-5822-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.021