益肾化浊方对阿尔茨海默病大鼠Bcl-2/Bax及α分泌酶蛋白可溶性淀粉酶前体蛋白α表达的影响

徐家淳 王 凯 覃启京 宋宛珊 孙伟明 郭 威 张玉莲

(天津中医药大学，天津 300193)



·基础研究·

益肾化浊方对阿尔茨海默病大鼠Bcl-2/Bax及α分泌酶蛋白可溶性淀粉酶前体蛋白α表达的影响

徐家淳 王 凯1覃启京1宋宛珊1孙伟明1郭 威1张玉莲

(天津中医药大学，天津 300193)

目的 探讨益肾化浊方对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠可溶性淀粉酶前体蛋白α(sAPPα)、α 分泌酶蛋白以及Bcl-2/Bax比值的影响。方法 将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、益肾化浊方组，每组10只。益肾化浊方组灌以中药，假手术组与模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，1次/d，共4 w。治疗后取海马标本并采用Western印迹检测大鼠海马中sAPPα、α分泌酶以及Bcl-2/Bax比值的表达。结果 与假手术组比较，模型组sAPPα、α分泌酶蛋白、Bcl-2/Bax比值表达明显降低(P<0.05)；与模型组相比，益肾化浊方组sAPPα、α分泌酶蛋白、Bcl-2/Bax比值明显升高(P<0.05)。结论 益肾化浊方可通过促进Bcl-2表达、抑制Bax表达提高Bcl-2/Bax比值，上调AD模型大鼠海马中sAPPα、α分泌酶蛋白，发挥抑制神经细胞凋亡、抑制Aβ的神经毒性作用。

益肾化浊方；阿尔茨海默病；Bcl-2/Bax；可溶性淀粉酶前体蛋白α；α分泌酶蛋白

β淀粉样蛋白(Aβ)是阿尔茨海默病(AD)病程发展的使动因素〔1〕，而细胞凋亡是导致AD神经细胞变性的重要病理机制〔2〕。AD的发生发展具有隐匿性和不可逆性，随着人口老龄化的快速发展，AD 已成为一种严重危及老年人生命的疾病。本课题组前期临床研究发现，益肾化浊方可显著改善轻度AD 患者症状，并对认知功能及日常生活能力有一定的改善作用〔3〕，其机制可能与改善突触形态学、调节Ca2+信号通路〔4〕、促进海马区脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体TrkB 蛋白的表达有关〔5〕，从而修复神经元损伤。在此基础上，本实验拟通过观察益肾化浊方对AD模型大鼠可溶性淀粉酶前体蛋白α(sAPPα)、α 分泌酶蛋白以及Bcl-2/Bax比值的影响，补充探讨益肾化浊方治疗AD的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 30只雄性SD大鼠(SPF级)，体重约200 g，购自北京大学医学部实验动物科学部，合格证号SCXK(京)2011-0012)，随机分为假手术组、模型组、益肾化浊方组，每组10只。采用大鼠右侧脑室注射聚集态的Aβ片段25～35(Aβ25～35)制备AD模型〔5〕。益肾化浊方组灌胃剂量按照文献〔6〕为4.32 g·kg-1·d-1，假手术组与模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，1次/d，共4 w。

1.2 药物及试剂

1.2.1 益肾化浊方 益肾化浊方组成：淫羊藿10 g、女贞子10 g、肉苁蓉10 g、川芎6 g、石菖蒲6 g、制首乌6 g。上述药物共48 g，一次性购于天津中医药大学第二附属医院，由天津中医药大学制剂中心制备，药液置于4℃冰箱保存。

1.2.2 其他试剂 Aβ25～35(Sigma公司)，Bcl-2抗体(Santa Cruz生物技术公司)，Bax抗体、sAPPα抗体、α分泌酶抗体(abcam公司)。

1.3 蛋白定量检测 将大鼠断颈处死，冰上取海马标本，裂解提取总蛋白，测定蛋白浓度，采用Western印迹检测sAPPα、α分泌酶以及Bcl-2/Bax蛋白的表达。图像结果采用 Image J 软件分析。

2 结 果

2.1 益肾化浊方对Bcl-2/Bax的影响 与假手术组(1.66±0.26)比较，模型组Bcl-2/Bax比值(0.61±0.08)明显降低(P<0.05)，与模型组相比，益肾化浊方组Bcl-2/Bax比值(1.10±0.05)明显升高(P<0.05)。见图1。

图1 益肾化浊方对Bcl-2/Bax的影响

2.2 海马区α分泌酶、sAPPα蛋白的表达结果 与假手术组(均为1)比较，模型组大鼠海马区sAPPα(0.07±0.01)、α分泌酶蛋白(0.31±0.03)表达显著下降(P<0.05)；与模型组相比，益肾化浊方组大鼠海马区sAPPα(0.56±0.08)、α分泌酶蛋白(0.56±0.02)表达明显升高(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠海马区α分泌酶蛋白、sAPPα表达

3 讨 论

本课题组前期证候学研究发现肾精亏虚、痰瘀阻窍是AD的常见证型〔7〕，因此，本课题组采用益肾化浊汤补肾益髓、化痰祛瘀，可有效改善轻度AD患者认知功能。方中女贞子补益肝肾，淫羊藿温助肾精，石菖蒲、川芎共达化浊通络之效。方中中药有效成分淫羊藿苷可减少Aβ毒性，减轻大鼠海马淀粉样蛋白斑沉积，且可有效改善认知状态〔8〕；β细辛醚可通过拮抗Aβ的神经毒性改善学习记忆障碍〔9〕；川芎嗪可有效提高AD模型小鼠学习和记忆能力〔10〕；齐墩果酸可通过下调JAK/STAT通路发挥神经保护作用〔11〕；且本课题组前期实验发现益肾化浊方可有效改善AD大鼠学习记忆能力〔4〕，但其作用机制尚待进一步研究。

凋亡是AD发展中神经细胞的主要死亡方式，而Bcl-2蛋白家族对调控凋亡过程有重要作用〔12〕。Bcl-2蛋白家族有两类，即Bcl-2和Bax，两者在功能上相互拮抗，Bcl-2抑制细胞凋亡；而Bax促进凋亡，而且还可抑制Bcl-2的抗凋亡作用，两者的比例是发生凋亡的关键因素〔13〕。因此，促进Bcl-2蛋白表达、同时抑制Bax蛋白的表达、提高Bcl-2/Bax比值，可阻止细胞凋亡。本实验表明益肾化浊中药可促进Bcl-2表达、抑制Bax表达，有效减少神经细胞凋亡。

连续沉积的Aβ具有神经毒性，可引发突触异变、Tau蛋白异常磷酸化等病变，对神经元功能造成损伤，是AD的重要病理基础〔14〕。Aβ 是淀粉样前体蛋白(APP)经过淀粉样代谢途径(β、γ分泌酶)产生的，APP 经过非淀粉样代谢途径(α、γ分泌酶)产生可溶性片段sAPPα，sAPPα具有神经营养和保护作用，能竞争性减少Aβ 的产生，从而延缓AD 的发展〔15〕。目前β、γ 分泌酶抑制剂的研究进展并不顺利，而激活α 分泌酶是一种治疗AD 的新靶点〔16〕。本实验结果显示益肾化浊方可上调AD模型大鼠海马中sAPPα、α分泌酶蛋白的表达量，该过程可减少Aβ的生成，从而抑制其神经毒性作用，延缓AD的发生发展。

综上所述，益肾化浊方可通过促进Bcl-2表达、抑制Bax表达提高Bcl-2/Bax比值，上调AD模型大鼠海马中sAPPα、α分泌酶蛋白，发挥抑制神经细胞凋亡、抑制Aβ的神经毒性作用，部分补充了益肾化浊方改善AD症状的作用机制。

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5 王 凯，张琳琳，宋宛珊，等.益肾化浊方对阿尔茨海默病模型大鼠海马区BDNF及其受体TrkB蛋白表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2015；21(5)：111-4.

6 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学〔M〕.第3版.北京：人民卫生出版社，2002：202-3.

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〔2016-03-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

Influence of Yishen Huazhuo decoction on the expressions of sAPPα, α-secretase protein, and Bcl-2/Bax of AD rats

XU Jia-Chun, WANG Kai, QIN Qi-Jing,et al.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China

Objective To observe the influence of Yishen Huazhuo Decoction(YHD)on soluble amylase precursor protein α (sAPPα), α-secretase protein, and Bcl-2/Bax of AD rats.Methods 30 male SD rats were randomly divided into sham, model, YHD groups, 10 in each group. Rats in YHD group were fed with Chinese medicine, and rats in sham and model groups were fed with normal saline, once daily for 4 weeks. After treatment, hippocampus were detected by Western blot, to observe the expressions of sAPPα, α-secretase enzyme, and Bcl-2/Bax.Results Compared with those of sham group, the expressions of sAPPα, α-secretase protein, Bcl-2/Bax ratio of model group were significantly reduced(P<0.05). Compared with those of model group, the expressions of sAPPα, α-secretase protein, and Bcl-2/Bax of YHD group were significantly higher(P<0.05).Conclusions YHD could promote the expression of Bcl-2, and inhibit Bax expression to increase Bcl-2/Bax ratio; and increase the expressions of sAPPα, α-secretase protein, to play the role of inhibiting neuronal apoptosis, and neurotoxic effects of Aβ.

Yishen Huazhuo decoction(YHD); Alzheimer′s disease; Bcl-2/Bax; Soluble amylase precursor protein α; α-secretase

国家自然科学基金项目(81273940，81473490)

1 天津中医药大学第二附属医院

张玉莲(1963-)，女，博士生导师，主要从事中医内科脑病研究。

徐家淳(1989-)，男，在读博士，主要从事中医内科脑病研究。

R28

A

1005-9202(2016)23-5769-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.001