珙桐的外植体选材及组织快繁启动

郭文久

（安康学院化学化工系/陕西省安康GAP工程技术研究中心，陕西安康725000）

珙桐的外植体选材及组织快繁启动

郭文久

（安康学院化学化工系/陕西省安康GAP工程技术研究中心，陕西安康725000）

珙桐(Davidia involucrata)是一种濒危的孑遗植物，由于其花形优美，在园林绿化中具有很大的应用价值。但珙桐种子繁殖或扦插等繁殖方式都非常困难，无论从种质保护还是经济应用的需要，开展珙桐的快速繁殖组织培养技术研究都十分重要。本研究对珙桐组织培养的外植体选择、消毒液升汞的不同浓度和基本培养基进行了详细研究。结果表明，选择春季的鳞芽及半木质化的带芽枝条效果较好，75%的酒精消毒10 s及0.1%升汞消毒10 min基本能达到要求，而基本培养基以WPM培养基效果最好。研究结果构建了珙桐的以芽繁芽技术体系，但组培苗的生根需要进一步研究。

珙桐组织培养；外植体选择；外植体消毒；WPM培养基

0 引言

珙桐(Davidia involucrate)是第三纪孑遗植物，同时其开花的时候，花色雪白、花形犹如展翅飞翔的鸽子，所以又叫鸽子树[1-5]。但是现在这个物种面临灭绝。对这个物种通过组织培养方法进行快速繁殖是恢复其生态种群的重要途径之一。同时各地绿化工程也在广泛地将珙桐作为行道树进行栽培，需求量巨大。由于珙桐具有极高的园林绿化价值，对珙桐进行组织快繁将产生巨大的经济效益[1,5-9]。

由于珙桐是一种高大的乔木，对大多数未经驯化的木本植物的组培都还存在一定的技术难度。主要是外植体的选材、消毒、褐变等问题不能很好解决。就珙桐而言，目前处于濒危状态，种子构造类似黑桃。最外层有一层果肉，果肉会自然干腐，但不会自行脱落，在果肉与种仁之间是一层厚厚的坚硬外壳，种子内部还有大量的败育情况，去掉种子外壳后无种仁的情况至少有1/3，所以通过种子繁殖的时候出苗率极其低下。珙桐还具有二次休眠，休眠时间最长达3年之久。要大面积恢复珙桐的生态种群，完全靠自然的种子繁殖将会存在较大的问题。国内外虽然有部分资料表明对珙桐进行了组培快繁，但效果都极其有限[6,10-13]。所以对珙桐的组培快繁仍然处于尝试阶段。我们主要是针对外植体选材、消毒、抗褐变等进行了初步研究，希望能建立一套高效的快速繁育体系。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

本研究仅进行了室内组织培养实验研究工作。实验在安康学院化学化工系隶属的陕西省安康GAP工程技术研究中心的药用植物组织培养实验室完成了所有研究工作。

1.2 试验材料

珙桐外植体选自2006年从陕西镇坪移栽到安康学院校内花园的植株及原安康市科技局家属院花园的植株。取材时间2014年3—10月。

外植体分别选取大树嫩枝、从大树旁边地上长出来的嫩枝、初春冬芽、秋季形成的冬芽做单因素消毒核繁殖启动试验。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计对基本培养基进行了单因素设计实验，处理A为MS全量、处理B为1/2MS、处理C为WPM全量，其他成分均为添加2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+40 g/L蔗糖+8 g/L琼脂粉，区组重复3次，一次做完所有处理为一个区组，每个处理重复25个350 mL培养瓶，每个培养瓶内含25 mL固体培养基。

对外植体的研究也是单因素室内随机区组试验，设置水平分别为大树幼芽、从大树旁边地里长出的幼枝、初春冬芽和秋季形成芽。重复方式同上。

消毒方法试验一样采用单因素随机区组法，处理水平为升汞(HgCl2)浓度梯度为0.01%、0.05%、0.1%及0.15%处理。消毒程序均为自来水反复清洗，随后75%酒精消毒10 s，然后进行不同浓度的升汞消毒试验。升汞消毒时间均为10 min。重复方式同上。

培养基的配制方法参见文献[14]。

启动的标准为培养1个月时观察幼芽萌发超过1cm。污染率记为培养1个月时瓶子内有杂菌菌落或者培养基表面有培养物之外的其他生物。

1.3.2 精密仪器和药品规格研究所用组培设备都是常用设备。包括上海博迅实业有限公司生产的YXQLS-75SII型高压灭菌锅、BOXUN SPX-300IC型微电脑人工气候箱和SW-CJ-2FD型洁净等级100级的超净工作台。大龙兴创实验仪器（北京）有限公司生产的1000～5000 μL和100～1000 μL DragonLAB移液枪。深圳市柯迪达电子有限公司生产的CT-6321型pH（笔式）酸度计。

国药集团化学试剂有限公司生产的α-萘乙酸(NAA)纯度≥98%、6-苄氨基嘌呤(6-BA)纯度≥99%、分析纯K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、MnSO4· 4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、Na2MoO4·2H2O、Ca(NO3)2·4H2O、FeSO4·7H2O、Na2EDTA、化学纯肌醇、甘氨酸、VB1、VB6、VB5；广东环凯微生物科技有限公司生产的技术琼脂粉。

1.3.3 统计分析所有数据统计分析都是采用的微软的Excel电子表格和SPSS处理和计算。统计显著水平均取5%。

2 结果与分析

2.1 外植体选择试验

试验应用多种方式进行选材，试材主要有大树嫩枝、从大树旁边地上长出来的嫩枝、初春冬芽和秋季形成的冬芽。试验结果参见图1。

图1 外植体启动试验结果

从图1可以看出，大树幼芽和秋季冬芽的萌发率低污染率高，不是理想的组织培养外植体。从大树旁边地上生长出来的幼芽和初春冬芽的萌发率高，而污染相对较少。而未启动的比率四者差异不是太大。主要问题还是集中在污染上。

2.2 消毒试验

外植体从田间采集下来之后，装于黑色干净的塑料袋中经过小于2 km的运输带回实验室。将外植体剪切成单芽的小段，断头在酒精灯上烧干封闭，以防止褐变。随后用自来水进行反复冲洗并用毛刷对表面及鳞芽附近角落进行了反复刷洗。之后室温晾干1～2 h。然后再进入酒精消毒和升汞消毒程序。对升汞消毒程序进行了优化。优化结果参见图2。

图2 不同升汞浓度消毒优化试验结果

从图2看出在0.01%和0.05%的低浓度升汞消毒结果中，几乎没有大的差异，污染率都很高。而在0.15%的高浓度处理中虽然没有污染，但是材料也基本杀死了。所以最适宜升汞浓度为0.1%。

2.3 培养基及激素配比试验

珙桐是一种没有驯化的濒危野生木本植物。之所以濒危是由于自身的繁殖力比较弱，生殖能力退化较为严重，推测可能对培养基的要求会比较特殊。所以有必要对培养基进行优化。

从图3可以看出，MS培养基基本上不分化，而1/2MS培养基的分化比例也是相当有限，只有约5%左右。而WPM培养基的状况就大为改观，分化率达到50%以上。

3 讨论

对组织培养外植体的选择与培养成功与否常常具有关键性的作用。不同季节、不同部位以及不同生长状态的外植体对组培成功与否都有巨大的影响。在本研究中发现，木质化程度较高的枝条消毒难度很大，无论怎么反复消毒，2～3天之后仍然会被污染，其原因可能就是污染病菌能够在木质部中存活，可以成功躲过消毒剂对病菌的伤害。相反，如果选用了木质化程度很低的新芽，一般的消毒程序大多会杀死新芽，虽然没有污染，但培养对象同时也被杀死了[9,15-22]。所以选择半木质化的外植体是繁殖成功的关键。

图3 基本培养基实验结果

同时珙桐的鳞芽对消毒和繁殖具有巨大的影响。早春的鳞芽优于秋季形成的鳞芽。据观察，可能主要原因在于污染状况的不同。早春的鳞芽因为经过了一个冬季之后，鳞芽中携带的病菌相对较少，所以容易启动，而秋季形成的、看起来很饱满的鳞芽，由于没有经过冬季的低温，所以鳞芽中包含大量的病菌，这些病菌由于鳞片的包裹而躲过了消毒剂的作用，最后还是会污染。在笔者的观察中发现，形成于3、4、5月的鳞芽繁殖率很高，这个时间形成的鳞芽较小，看起来不饱满，但很容易消毒，经过培养也很容易启动。同时还观察到，大的鳞芽由于鳞片的阻挡还会使启动后的新芽受到鳞片的机械阻挡而导致新芽生长夭折。

总的来说，对于珙桐外植体的选择，最好是选自秋冬形成的鳞芽，2～5月来进行培养，这段时间的鳞芽消毒较为容易、启动频率较高，在培养瓶中的生长速度也比较快，与其他人研究结果类似[6,9,23-29]。

研究比较了升汞和二氯异氰尿酸钠（有效成分为次氯酸钠）多个浓度的消毒效果，发现升汞的效果要优于二氯异氰尿酸钠。但是升汞的毒性和消毒液的处理确实存在较大的麻烦。坚持使用升汞作为消毒剂实属无奈之举。

在升汞的不同浓度的消毒效果比较中，发现0.1%和0.15%都是可行的，只要控制好消毒时间，都可以达到较为满意的效果。浓度较高的时候，适度缩短消毒时间就可以了。

本研究中也比较了基本培养基对珙桐组培的影响。图3展示的只是启动的情况。笔者发现，不论是全量MS或者是1/2MS培养基都存在问题，培养效果都不理想，只有WPM培养基具有较好的效果。全量MS培养基可能是由于总盐浓度较高的原因，在初代培养或者转接培养中几乎都没有反应或者转接物死亡，而WPM培养基就能顺利的生长。这与国内较早的研究认为N6培养基较好不一致[10-12]，由于没有比较过WPM与N6培养基，孰优孰劣也未可知。与四川农业大学的研究结果认为最佳的是1/2MS培养基也不一致[9-13,30-32]，在笔者的实验中1/2MS效果很差。

4 结论

笔者对珙桐组织培养前后进行了近1年的研究，也设计了多个试验，主要围绕外植体选择、消毒、基本培养基的选择以及激素种类和配比的选择。虽然有了一些初步的结果，但结果并不是非常满意。珙桐的组织培养具有一定的难度，猜想主要可能是由于珙桐是一种濒危植物，自身繁殖力比较弱，同时还由于目前使用的珙桐材料都是未经驯化的野生物种，这种外植体对消毒剂、基本培养基总盐浓度的耐受力等都比较弱[3,7-8,13,33]。同时，本研究虽然实施了多个试验计划，但未能获得生根植株，也是今后继续进行研究的动力。

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致谢：本研究的部分工作有安康学院化学化工系化学工程与工艺专业2010级7名学生参与，这7名同学分别是马祥祥、成云、潘双全、王康军、谭静、张宁、张薇。作者在此对7名同学的工作表示真诚的感谢。

Explant Selection and Micro Propagation Start of Davidia involucrata

Guo Wenjiu
(Department of Chemistry&Chemical Engineering,Ankang University/ Ankang GAP Engineering Technology Centre of Shaanxi Province,Ankang 725000,Shaanxi,China)

Davidia involucrata is an endangered ancient relic species.As the flower shape of Davidia involucrata is graceful,it has great application value in gardening.But Davidia involucrata has obstacles in seed and shoot cutting propagation.Therefore,it is urgent to develop the technology of plant tissue culture for establishing a fast propagation system according to the needs of both germplasm conservation and economic application.In this research,explant selection,different concentrations of mercuric chloride disinfectant and basal culture media were explored.The results showed that spring bud and semi-lignified branches with bud were the best explants,and 75%alcohol disinfection for 10 s and followed by 0.1%HgCl2disinfection for 10 min could meet the need,and the WPM basal media had the best effect.The results built the bud proliferation technique system,but the rooting of cultured seedlings need to be further studied.

Davidia involucrata Tissue Culture;Explant Selection;Explant Disinfection;WPM Culture Media.

S688.2

A论文编号：cjas15030023

陕西省科学技术研究发展计划项目“珍惜观赏植物珙桐组织快繁关键技术研究”(2014K14-01-10)；陕西省教育厅省级重点实验室科研计划项目“组织培养法多倍体桑树遗传材料创新研究”(13JS002)；陕西省自然科学基础研究计划项目“濒危药用植物阴地蕨快速繁殖研究”(2013JM4017)。

郭文久，男，1964年出生，副教授，博士，研究方向为野生药材及绿化植物资源开发与利用。通信地址：725000陕西省安康市育才路92号安康学院化学化工系，Tel：0915-3261915，E-mail：gwjdata@163.com。

2015-03-18，

2015-10-27。