基于HS-SPME/GC-MS和感官分析技术的单菌发酵对咖啡果酒风味影响研究

2016-12-22胡荣锁周晶董文江陆敏泉宗迎

农学学报 2016年2期

胡荣锁，周晶，董文江，陆敏泉，宗迎

（1中国热带农业科学院香料饮料研究所；海南万宁571533；2国家重要热带作物工程技术研究中心；海南万宁571533；3中国热带农业科学院热带生物技术研究所；海口571533）

胡荣锁1,2，周晶3，董文江1,2，陆敏泉1,2，宗迎1,2

为探讨单菌发酵对果酒风味的影响，利用GC-MS分析对风味影响的物质基础，利用电子感官（电子鼻和电子舌）和人为感官判定菌种对咖啡果酒整体风味的影响，研究结果为酿造优质风味咖啡果酒筛选最佳菌种组合提供理论参考。实验结果表明，4种酵母中B和D酿成的果酒中乙醇的相对含量高于其他2种，C损失略高于其他3种酵母。GC-MS分析共检出化合物26种，其中酯类15种、醇类7种、其他化合物4种；所检化合物除酸类物质外，均具有令人愉悦的风味；醇类均为高级醇，主要是异戊醇和苯乙醇；酵母D峰面积明显高于其他3种，而醇酯比C(8.61)＞A(4.17)＞B(1.16)＞D(1.05)。电子感官检测发现，电子鼻和电子舌的第1主成分的贡献率均达到98%以上，但大多存在交叉，区分效果较差，说明风味和口感较为接近；人为感官区分结果与电子感官结果一致。

咖啡；果酒；风味；电子感官

0 引言

中国咖啡种植面积已超过12万hm2，年产咖啡果皮40万t。目前咖啡果皮除少量作为肥料还田外，其余大量堆积废弃；既是对资源的浪费，也对当地生态环境造成不良的影响。

国内对咖啡果皮的综合利用研究较少，研究不深，如石磊等[1]报道咖啡果肉可用于牲畜饲料，对其生长性能具有一定的促进作用；利美莲等利用种咖啡干果皮为原料发酵生产咖啡果酒，取得了良好的风味口感[2]，在此基础上对其生产工艺进行优化处理，取得了较好的效果[3]；韩洪波等[4]建立了一种咖啡果皮咖啡因的测定方法，其测定咖啡因含量为1.79%。而国外在咖啡果皮（包含果肉）的综合利用研究主要集中在成分检测、动物饲料和生物利用方面。成分检测方面主要检测了咖啡果皮中的多酚、咖啡因和单宁成分[5-6]。动物饲料研究主要是利用生物技术处理咖啡果皮和果肉，增强营养成分，更加适合生物喂养，且具有改善肉质的作用[7-10]；而在生物利用方面主要是在产酶[11]、生物乙醇[12]和沼气[13]的应用；在咖啡果酒生产应用尚未见报道。

本项目是在响应面优化发酵条件的基础上，研究4种酵母单菌发酵果酒风味差异，为选择最佳发酵菌种或最佳菌种组合提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料为云南小粒种咖啡果皮，收集自云南省普洱市，由云南农业大学热带作物学院协助收集。纤维素酶为Celluclast 1.5 L，自黑曲霉(Aspergillus niger)中提取，购自诺维信公司(Novozymes)公司，果胶酶购自南宁庞博生物工程有限公司，酿酒酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号依次为A—1425、B—1557、C—1793、D—32762，正构烷烃(C7～C30)购自美国Supelco公司，亚硫酸氢钠（分析纯）、蔗糖（市售级）、麦芽汁培养基粉、0.45 nm有机相膜等，酿造用水为超纯水。

SPME手动进样手柄及萃取头（纤维头），上海安谱科学仪器有限公司；7890A-5975C气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司；HS-100型自动进样器，瑞士CTC公司；α-Astree型电子舌味觉分析系统，法国Alpha.MOS公司；α-Genemi型电子鼻，法国Alpha. MOS公司；Z36HK型超速冷冻离心机，德国Hermle公司，LE 438型pH计，瑞士Mettler-Toledo公司。

实验时间为2015年4—6月，在中国热带农业科学院香料饮料研究所综合实验楼完成。

1.2 实验方法

1.2.1 咖啡果酒酿造方法准确称取咖啡果皮5 g，装入250 mL三角瓶中，加入纤维素酶3 mL，50℃下酶解3 h，加入白砂糖22.5 g、亚硫酸氢钠0.008 g（发酵液中SO2浓度约为35 mg/L），自然pH，1×105Pa灭菌20 min，冷却后接入对数期菌种2 mL，28℃120 r/min摇床发酵3天，发酵结束后发酵液9000 r/min离心10 min。

1.2.2 咖啡果酒产品指标测定酒精含量测定采用蒸馏法；糖含量测定采用手持糖量计；酸度测定采用pH计。

1.2.3 咖啡果酒香气成分检测方法

（1）SPME前处理。取2 mL发酵好的咖啡果酒（按0.3 g/mL加氯化钠），放入20 mL的顶空瓶中，50℃下预热20 min，插入萃取头吸附30 min，将萃取头插入气相色谱进样口，250℃解吸附5 min。

（2）气质条件。初始温为50℃，保持5min，以5℃/min升温至240℃，然后以1℃/min升温到250℃。载气为氦气；流量为1.0 mL/min。离子源为EI源模式．电子轰击能量70 eV，离子源温度为230℃，接口温度280℃，扫描范围30～350 amu。色谱库NIST 08。积分开始时间为5.00 min，以避免溶剂峰[14]。

1.2.4 咖啡果酒感官检测方法

（1）电子舌检测方法。样品处理：取离心后发酵液样品20 mL加入150 mL样品杯，添加超纯水60 mL。检测条件：清洗时间10 s；搅动速度1 r/s；采集温度25℃；采集时间210 s；传感器类型：ZZ、BA、CA、HA、GA、BB、JB，重复8次[15]。

（2）电子鼻检测方法。样品处理：取发酵液10 mL倒入9 cm平板，加入有机相液相过滤膜12份（每张平均分成4份），盖上平板盖，静置放置3 h，取其中2份加入10 mL样品瓶密封。检测条件：采用顶空进样；载气为空气；流速150 mL/min；进样量1500µL；采集延迟210 s；孵化期300 s；温度80℃；注射器温度90℃，重复4次[15]。

（3）人为感官检测方法。检测指标参考咖啡杯品指标，设定风味、香味、后味、甜度、酒度、酸度、清洁度和平衡度共8个指标。检测人员由产品加工专业人员组成方法，4男3女组成评判小组，检测数值求平均值。

1.2.5统计学方法使用主成分分析来表达电子舌和电子鼻检测结果。

2 结果与分析

2.1 酶解糖化效果分析

使用纤维素酶和果胶酶将咖啡果皮进行酶解，通过糖量计进行检测，同时将检测温度修正为标准温度下白利糖度，然后转化为百分比浓度，以求咖啡果皮转化糖的含量，进而求转化率。由表1可知，咖啡果皮转化率均达到68%以上，Murthy[16]的研究表明，咖啡果皮中纤维素63.0%、果胶17.5%，即纤维素和果胶占总含量的80.5%，由此可知本实验中纤维素酶果胶酶糖化降解率达到85%以上，酶解糖化效果良好。

2.2 菌种对咖啡果酒发酵效果分析

为测定菌种发酵效果，以发酵前后糖度、酸度、产生的酒精量及发酵过程中糖损失率为指标进行评判，具体结果见表2。

由表2可知，4种酿酒酵母发酵后糖度、酸度均有所下降，下降后各指标差异较小，理论酒精度和实际酒精度之间存在差异较大，可知在发酵过程中糖存在损失，其中C酵母损失最多，达到2.49%。糖损失可能是使用摇床发酵造成的。酿酒酵母在发酵过程有2条转化途径，在厌氧条件下产生乙醇，在有氧条件下产生二氧化碳和水，在摇床过程中虽然增加了酿酒酵母和糖的接触率，加快了反应速率，但也使发酵液中氧含量增加。

2.3 发酵菌种对果酒风味组分差异分析

使用峰面积归一化法确定咖啡果酒风味化合物的含量，对化合物的鉴定采用与NIST 08质谱库对比，结合人工检索，确定其化学组成；同时由于使用的是DBWAX色谱柱未检索到相关的保留指数，因此本实验中仅有正构烷烃确定的线性保留指数。化合物风味描述部分借鉴冯爱军等[17]和范文来等[18]的研究成果，其他组分风味描述来自网络。

表3表明，咖啡果酒中共检出化合物26种，其中酯类15种、醇类7种，其他化合物如醛类、酸类和酮类共4种。从风味描述可以看出，所检化合物除酸类物质外，均具有令人愉悦的风味。由于积分是从5 min开始，甲醇和乙醇未检出；所检醇类均为高级醇，主要是异戊醇和苯乙醇，该高级醇组成与刘晓艳等[19]研制柿子酒中高级醇组成一致。

表1 纤维素酶果胶酶酶解糖化效果分析

表2 菌种对咖啡果酒发酵效果分析

各菌种化合物、峰面积及醇酯比分析结果见表4，可见各菌种化合物数量差异不明显，醇类和酯类为主要化合物；峰面积部分差异显著，含量最多的为D，其次为A，酵母B和C峰面积含量几乎一致。

醇酯比是指高级醇和总酯的比值。高级醇和酯类物质是果酒风味物质的重要组成部分。醇酯比过高则酒味过浓，香味不足；醇酯比过低则香味过浓，酒味不足，则失去果酒本身意义，因此本实验将醇酯比作为一项重要指标。果酒中醇酯比范围目前尚未有统一标准，但在啤酒中孟艳丽[20]认为醇酯比(3～5):1，酒体具有风味比较协调、柔和。在本实验中酵母C醇酯比最高为8.61，其次为酵母A为4.17，酵母B和D醇酯比较为相似在1.0～1.5。

表3 不同菌种酿造果酒风味差异性分析

表4 不同酵母风味分析结果比较

2.4 发酵菌种对果酒感官评价差异分析

2.4.1 人为感官评价差异分析咖啡果酒感官指标借鉴咖啡杯品，分别从香味、风味等8个指标对咖啡果酒进行打分，得分结果见图1。从图1可以看出，各菌种发酵的果酒均具有独特的优势，如酵母C在平衡度、清洁度、甜度和风味；酵母A在香味、后味和酸度，酵母B在甜度、香味和清洁度，酵母D在清洁度均具有较高的得分，但同时也具有各自的缺点，酵母C发酵果酒整体得分最高。

2.4.2 电子感官评价差异分析PCA分析是在样品特性未知的前提下，通过变换观察视角来寻找样品间差异的一种算法。该算法不丢失任何样品信息，仅通过改变坐标轴来达到区分样品的目的[21]。对A、B、C和D酵母发酵果酒进行电子感官（电子舌和电子鼻）PCA分析，整体判断各发酵果酒在风味和口感上的差异，分析结果见图2～3。从图2～3可以看出，各发酵果酒第1主成分的贡献率均达到98%以上，说明不同菌种发酵果酒的差异主要体现在第1主成分上。同时发现各菌种发酵果酒虽相对集中但存在交叉现象，区分效果较差，区分指数不高，说明各菌种发酵果酒在风味和口感上存在差异小。而图3中酵母D发酵果酒与其他3种存在显著差异，说明该果酒与其他3种在口感上相差较大，该结果与人为感官较为一致。

图1 各菌种发酵果酒感官评价结果图

图2 不同菌种发酵果酒电子鼻PCA分析图

3 结论与讨论

（1）果酒、白酒等酒制品风味检测存在多种检测方式，最常用的是液液萃取、固相微萃取，此外还有液相微萃取，如姜自军等[22]。在固相微萃取中对萃取头的选择同样存在多种方式，如苏海荣[23]、张斌等[24]选择100µm PDMS萃取头，刘晓艳等[19]、冯爱军[17]选择使用75µm CAR/PDMS萃取头，李美萍等[25]使用50/30µm DVB/CAR/PDMS，而张巧珍[26]等则认为65µm PDMS/ DVB萃取头最佳。不同萃取头对咖啡果酒风味组分的选择性吸收有一定的偏好性，对本研究而言，咖啡果酒中主要是酯类和醇类物质，其次还有醛类和酸类等，该系列组分一般极性都偏强，根据极性和挥发性，75µm CAR/PDMS萃取头较为适合本研究。

图3 不同菌种发酵果酒电子舌PCA分析图

（2）在感官分析中电子感官（电子舌和电子鼻）PCA分析中各果酒相互交叉，区分度较差，整体风味较为接近；人为感官中同样发现各果酒不存在较大差异，但同时发现具有独特的优势和劣势，因此下一步将进行混菌发酵，以确定最佳发酵组合，生产最佳咖啡果酒。

（3）本研究中以峰面积表示化合物含量，对化合物含量统计，此方法虽较为常用，但科学性欠佳。化合物水中阈值具有差异性，因此化合物含量高低并不一定表示香味浓郁与否，应用内标法定量表示化合物含量，且与阈值对比，确定强度值。

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Flavor Impact of Single Strain Ferment on Coffee Wine Based on HS-SPME/GC-MS and Sensory Analysis Technology

Hu Rongsuo1,2,Zhou Jing3,Dong Wenjiang1,2,Lu Minquan1,2,Zong Ying1,2

(1Spice and Beverage Research Institute,CATAS,Wanning 571533,Hainan,China;2National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research,Wanning 571533,Hainan,China3Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,CATAS,Haikou 571533,Hainan,China)

The aim of this paper was to investigate the effects of single stain fermentation on coffee wine flavor. The gas chromatography-mass spectrometer(GC-MS)was utilized to analyze the coffee wine flavor compounds of stain fermentation,and electronic sensory(e-nose and e-tongue)and human sensory were utilized to evaluate the overall flavor effect of coffee wine.The study provided a theoretical reference for brewing highquality coffee flavor wine and selecting the optimum strain combination.The experimental results showed that the ethanol value of the yeast B and D brewed coffee wine was higher than the others,while the loss rate of the yeast C brewed coffee wine was slightly higher than the other three kinds of yeast.The GC-MS detected 26 compounds,including 15 esters,7 alcohols,and 4 other compounds.The detected compounds were in addition to the acids,had a pleasant flavor.The alcohol compounds all were higher alcohols,mainly 3-methyl-1-butanol and phenylethyl alcohol.The peak area of yeast D was significantly higher than that of the other three kinds of yeast;the alcohol ester ratio was C(8.61)＞A(4.17)＞B(1.16)＞D(1.05).Electronic sensory testingshowed that the first principal component analysis contribution rate of electronic nose and electronic tongue was more than 98%,but most regions were overlapped and had the poor distinguish effect,indicating that the coffee wine brewed with the four kinds of Saccharomyces cerevisiaes had close flavor and taste.Human sensory distinguishing had the same result.

Coffee;Fruit Wine;Flavor;Electronic Senses

S-3

A论文编号：cjas15070011

中国热带农业科学院院本级基本科研业务费专项资金“发酵菌种对咖啡果酒风味影响研究”(1630052015043)。

胡荣锁，男，1982年出生，山东济宁人，硕士，研究方向为热带作物加工。通信地址：571533海南省万宁市兴隆镇香料饮料研究所，Tel：0898-62556090，E-mail：hnhrs@126.com。

陆敏泉，男，1972年出生，副研究员。通信地址：571533海南省万宁市兴隆镇香料饮料研究所，Tel：0898-62556090，E-mail：lmq663@126.com。

2015-07-20，修回日期：2015-09-25。