肉质性状相关基因在四种鲤科鱼类肌肉组织中的表达差异研究

赵燕英，李瑞文，李 虎，李 倩，林亚秋，陈 娟

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.成都市妇女儿童中心医院，四川 成都 610091；3.新乡医学院，河南 新乡 453003)

肉质性状相关基因在四种鲤科鱼类肌肉组织中的表达差异研究

赵燕英1，李瑞文2，李 虎3，李 倩1，林亚秋1，陈 娟1

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.成都市妇女儿童中心医院，四川 成都 610091；3.新乡医学院，河南 新乡 453003)

为了阐明肉质性状相关基因在四种鲤科鱼类中的表达差异，以齐口裂腹鱼(雅鱼，Schizothorax prenanti)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)和鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)四种鲤科鱼类为研究对象，利用索式抽提法和物性测定仪测定四种鱼类背部与腹部肌内脂肪(IMF)含量和肌肉剪切力，并利用荧光定量PCR(qPCR)检测心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、过氧化物酶体激活增殖受体γ(PPARγ)、过氧化物酶增殖剂受体γ亚型的辅激活因子1α(PGC-1α)、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)等肉质性状相关基因在四种鱼肌肉组织中的表达.结果显示，齐口裂腹鱼背部与腹部肌肉的IMF含量极显著高于其他鱼类(P＜0.01)，而肌肉剪切力均显著低于其他三种鱼类(P＜0.05)，PGC-1α在齐口裂腹鱼背部及腹部肌肉中表达水平最高，PPARγ和CAST在齐口裂腹鱼背部及腹部肌肉中表达水平最低.研究结果为阐明齐口裂腹鱼优良肉质形成的分子机制提供重要的参考数据.

齐口裂腹鱼；草鱼；鲤鱼；鲢鱼；肌内脂肪含量；剪切力；基因表达

近年来人们对肉类产品的要求越来越高，不仅要求营养丰富，而且还需具有较好的风味和感观性状.据统计在发展中国家，人们所摄取的动物蛋白25%来自水产品[1]，其中鱼肉由于其特有的优点越来越受到人们的青睐.但关于动物肉质调控方面的研究多集中于哺乳动物，在鱼类上研究相对匮乏，尚不深入.

肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)和嫩度是影响肉质性状(包括肉质风味、嫩度和多汁性)的重要因素[2]，因此检测IMF和嫩度相关基因在不同鱼类肌肉的表达差异具有重要的理论与实际意义.

哺乳动物研究表明，影响动物IMF沉积的关键基因有很多，比如心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acidbinding protein，H-FABP)家族[3-5]、过氧化物酶体激活增殖受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)家族[6-7]、过氧化物酶增殖剂受体γ亚型的辅激活因子(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)[8]等.钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin，CAST)是影响肉嫩度的主要候选基因[9-10].但关于上述基因在鱼类中的报道较少，且不深入.

齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)是我国青藏高原特有的冷水性鱼类，属鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属，因肉色雪白、肉质细嫩、肉味鲜美、富含脂肪与赖氨酸[11]，已逐渐成为我国重要的经济鱼类，备受人们推崇，研究其优良肉质形成的分子机理具有非常重要的意义.因此本试验以齐口裂腹鱼和同一鲤科的草鱼、鲤鱼和鲢鱼为研究对象，通过测定四种鱼类IMF与剪切力及同时比较相关基因的表达差异，为从分子水平阐明齐口裂腹鱼优良肉质形成的分子机制提供基本数据，为鱼类肉质的调控研究提供重要的理论依据，同时对鱼类的品种选育及遗传资源的利用提供参考资料.

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验所用成年齐口裂腹鱼(497±9.7g，n＝8)购买于四川省雅安市芦山养殖场，成年草鱼(850±12g，n＝8)，鲤鱼(758±16g，n＝8)，鲢鱼(756±23.4g，n ＝8)均购自成都白家水产市场.宰杀后迅速采集四种鱼的背肌和腹肌，然后迅速置于液氮中用于后续基因表达检测.同时采集每条鱼的背肌和腹肌各4块肌肉，每块肉厚0.5cm，长宽各1cm，且去除鱼刺及鱼皮，放于-20℃冰箱待测定剪切力及肌内脂肪含量.

1.2 主要试剂

Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，Fermentas RNA反转录试剂盒(Fermentas Life Science，Hanover，MD，US)，SYBR© Premix Ex TaqTM(2×)荧光定量试剂盒(TaKaRa，Dalian，China)，TaqMix聚合酶(TaKaRa，Dalian，China)，pMD19-T vector(TaKaRa，Dalian，China).

1.3 方法

1.3.1 四种鲤科鱼类IMF与剪切力的测定

从-20℃冰箱取出冷冻的四种鱼肉样品，放入冰箱4℃熟化12 h，然后利用物性测定仪测定其剪切力，利用索氏抽提法测定IMP含量.

1.3.2 RNA提取及反转录

从液氮中取出四种鱼类的背肌和腹肌样品，然后按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计鉴定其质量.取1μg总RNA按照反转录试剂盒说明书，以Oligo(dT)为引物合成cDNA.

1.3.3 荧光定量PCR

利用Primer Premier 5.0软件，根据GenBank上登录的序列:鲤鱼 H-FABP(GU205785.1)，草鱼PPARγ(EU847421)，鲤鱼PPARγ(FJ849064.1)，草鱼PGC-1α(JN195738)，草鱼 CAST(JF825477)，鲤鱼CAST(JX275386)，草鱼beta-ACTIN(DQ211096)，鲤鱼beta-ACTIN(JQ013000)设计四种鱼所对应的引物(表1).荧光定量 PCR反应体系为:10 μL SYBR© Premix Ex TaqTM(2×)PCR，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA 1μL，加水至20 μL.反应条件为95°C预变性1 min，95°C 30 s，53.2-62℃ 30 s，45个循 环，72°C延伸30 s.

表1 引物序列表Table 1 primer sequence

1.3.4 统计分析

本研究中不同鱼类肌内脂肪，肌肉剪切力以及基因相对表达结果使用Graphpad Prism软件分析，F检验，当p＜0.05时，被认为差异显著.

2 结果与分析

2.1 四种鲤科鱼类肉质性状测定结果

四种鲤科鱼类背肌和腹肌样品通过索氏抽提器测得肌内脂肪含量如图1所示，齐口裂腹鱼背部与腹部的IMF含量极显著高于其他鱼类腹部的IMF含量.

图1 四种鱼类肌内脂肪含量的比较(A，背部；B，腹部)(∗∗P＜0.01，∗∗∗P＜0.001)Fig.1 Intramuscular fat content in the four kinds of fish

四种鱼背肌和腹肌样品通过物性仪测得剪切力结果见表2，由表2可以看出这四种鱼的背部肌肉的剪切力均大于腹部肌肉的剪切力，且齐口裂腹鱼背部和腹部的剪切力均显著低于其他三种鱼类(P＜0.05)，说明齐口裂腹鱼的腹部肌肉最嫩.

表2 四种鱼背、腹部肌肉剪切力分析结果Table 1 Dorsal and abdominal muscle shear force analysis of four kinds of fish

2.2 肉质性状相关基因检测结果

qPCR检测肉质性状相关基因(H-FABP、PPARγ、PGC-1α和CAST)在四种鲤科鱼类背肌和腹肌中的表达，结果显示以齐口裂腹鱼为参考对象，H-FABP基因在齐口裂腹鱼的背肌及腹肌中表达水平比鲫鱼高；PGC-1α基因在齐口裂腹鱼的背肌及腹肌中表达水平最高(P＜0.05).PPARγ在齐口裂腹鱼的背部及腹部肌肉中表达水平最低(P＜0.05).CAST基因在齐口裂腹鱼的背部及腹部肌肉中表达水平最低(P＜0.05)(图2).

图2 四种鱼背部和腹部肌肉中H-FABP，PPARγ，PGC-1α，CAST基因的表达(∗P＜0.05，∗∗P＜0.01，∗∗∗P＜0.001)Fig.2 Relative expression levels of H-FABP，PPARγ，PGC-1α，CAST in the dorsal and abdominal muscles of four kinds of fish.

3 讨论

本实验比较了齐口裂腹鱼、草鱼、鲤鱼和鲢鱼四种鲤科鱼类肌肉组织剪切力和IMF含量的差异，结果发现齐口裂腹鱼背肌和腹肌的剪切力均显著低于其他三种鱼类，IMF含量显著高于其他三种鲤科鱼类，结果提示齐口裂腹鱼肉质较其他三种鲤科鱼类细嫩.

为了揭示其肉质优良的可能原因，本实验利用qPCR技术检测了与IMF和嫩度有关的候选基因HFABP、PPARγ、PGC-1α与CAST等在四种鲤科鱼类肌肉组织中的表达.结果指出，H-FABP、PGC-1α在齐口裂腹鱼的背部及腹部肌肉中表达水平最高，与IMF含量变化趋势一致；PPARγ则表达水平最低，与IMF变化趋势相反，提示齐口裂腹鱼可能通过正调控 HFABP、PGC-1α及负调控PPARγ基因变化来促进IMF沉积.具体的相关性分析及作用机制还需要进一步通过实验来验证.已有研究证明H-FABP基因在不同动物中均与IMF含量存在相关性[12-14]，但不同动物相关结果存在差异，比如在猪中与 IMF含量呈正相关[12]，在鸡中却呈负相关[13].综合上述结果可以发现H-FABP基因表达水平与动物肉质调控的关系可能存在物种特异性.研究表明PGC-1α可作为动物肉质性状的候选基因，抑制成肌细胞增殖[15]，影响肌纤维类型的转化，并与IMF含量呈正相关[16].与本实验中肌内脂肪含量较高的齐口裂腹鱼中PPARγ含量较低的结果不同，王丽等指出，PPARγ在5和7周龄低脂系肉鸡脂肪组织中的表达水平低于高脂系中的表达水平[17]，结果不同的原因可能是不同物种，不同研究部位所致.本实验中测得CAST基因在齐口裂腹鱼的背部及腹部肌肉中表达水平最低，与剪切力变化趋势一致.已知CAST是一种内源性的、需Ca2＋激活的钙蛋白酶抑制剂，通过抑制p-calpain的一系列变化来进一步影响肌肉的嫩度，在肉的嫩化过程中发挥着重要作用[18].

综上所述，本实验发现齐口裂腹鱼肌肉组织与其他三种鲤科鱼类相比，其IMF含量最高，剪切力最低.并且发现肉质性状相关基因H-FABP与PGC-1α在齐口裂腹鱼肌肉组织中表达高于其他鱼类，PPARγ与CAST基因在齐口裂腹鱼肌肉组织中的表达水平低于其他鱼类.但这些相关基因具体如何调控齐口裂腹鱼优良肉质形成的分子机制需要进一步进行研究阐明.

[1]FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS.Aquaculture production statistics，1984-1993[M].Rome: 1995，186.

[2]WANG Y H，BYRNE K A，REVERTER A，et al.Transcriptional profiling of skeletal muscle tissue from two breeds of cattle[J].Mammalian Genome，2005，16(3):201-210.

[3]WANG Y，HE J，YANG W，et al.Correlation between heart-type fatty acid-binding protein gene polymorphism and mRNA expression with intramuscular fat in baicheng-oil chicken[J].Asian-Australasian J Animal Sciences，2015，28(10):1380-1387.

[4]CHEN Q M，WANG H，ZENG Y Q，et al.Developmental changes and effect on intramuscular fat content of H-FABPand A-FABP mRNA expression in pigs[J].Journal of Applied Genetics，2013，54(1):119-123.

[5]LEE S H，CHOI Y M，CHOE J H，et al.Association between polymorphisms of the heart fatty acid binding protein gene and intramuscular fat content，fatty acid composition，and meat quality in Berkshire breed [J].Meat Science，2010，86(3):794-800.

[6]LIM D，CHAI H H，LEE S H，et al.Gene Expression patterns associated with peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)signaling in the longissimus dorsi of Hanwoo(Korean Cattle)[J].Asian-Australasian J Animal Sciences，2015，28(8):1075-1083.

[7]LI L，JIANG J，WANG L，et al.Expression patterns of peroxisome proliferator-activated receptor gamma 1 versus gamma 2，and their association with intramuscular fat in goat tissues[J].Gene，2013，528(2):195-200.

[8]LI R W，LIN Y Q，ZHENG Y C，et al.Cloning，expression and polymorphism analysis of PGC-1α gene of Schizothorax prenanti[J].Asian Journal of Animal＆Veterinary Advances，2012，7(10):928-939.

[9]ROPKA-MOLIK K，BERETA A，TYRA M，et al.Association of calpastatin gene polymorphisms and meat quality traits in pig[J].Meat Science，2014，97(2):143-150.

[10]AALI M，MORADI-SHAHRBABAK M，MORADI-SHAHRBABAK H，et al.Detecting novel SNPs and breed-specific haplotypes at calpastatin gene in Iranian fat-and thin-tailed sheep breeds and their effects on protein structure[J].Gene，2014，537(1):132-139.

[11]方静，潘康成，邓天怀.齐口裂腹鱼肌肉营养成分分析[J].水产科学，2002，21(1):17-19.

[12]GERBENS F，VERBURG F J，VAN MOERKERK H T，et al.Associations of heart and adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fat content in pigs[J].Journal of Animal Science，2001，79(2):347-354.

[13]李文娟，李宏宾，文杰，等.鸡H-FABP和A-FABP基因表达与肌内脂肪含量相关研究[J].畜牧兽医学报，2006，37(5):417-423.

[14]林亚秋，李瑞文，郑玉才，等.齐口裂腹鱼和鲤鱼H-FABP基因的克隆及其表达谱[J].中国生物化学与分子生物学报，2011，27(6): 493-498.

[15]林亚秋，谈永萍，赵燕英，等.PGC-1α对C2C12成肌细胞增殖的影响[J].西南民族大学学报(自然科学版)，2014，40(6):814-817.

[16]LIN Y Q，ZHAO Y Y，LI R W，et al.PGC-1α is associated with C2C12 myoblast differentiation[J].Central European Journal of Biology，2014，9(11):1030-1036.

[17]王丽，那威，王宇祥，等.鸡PPARγ基因的表达特性及其对脂肪细胞增殖分化的影响[J].遗传，2012，34(5):454-464.

[18]DELGADO E F，GEESINK G H，MARCHELLO J A.Properties of myofibril-bound calpain activity in longissimus muscle of callipyge and normal sheep[J].Journal of Animal Science，2001，79(8):2097-2107.

(责任编辑：李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑：周序林，郑玉才)

Study on expression difference of genes related to meat quality in muscle tissue of four cyprinid fishes

ZHAO Yan-ying1，LI Rui-wen2，LI Hu3，LI Qian1，LIN Ya-qiu1，CHEN Juan1

(1.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.Reproductive and Endocrine Laboratory，Chengdu Woman-Child Central Hospital，Chengdu 610091，P.R.C.；3.School of Life Science and Technology，Xinxiang Medicine University，Xinxiang 453003，P.R.C.)

In order to clarify the expression difference of genes related to meat quality in muscle tissue of four cyprinid fishes，Schizothorax prenanti，Ctenopharyngodon idellus，Cyprinus carpio and Hypophthalmichthys molitrix were selected as the research objects in this study.The intramuscular fat(IMF)content and shear force of the dorsal and abdominal muscles of four cyprinid fishes were detected by using Soxhlet extraction method and texture analyzer.In addition，quantitative RT-PCR was used to detect the relative expression of genes related to meat quality in muscle tissues of four cyprinid fishes，including heart fatty acidbinding protein(H-FABP)，peroxisome proliferators-activated receptor γ(PPARγ)，PPAR gamma coactivator-1α(PGC-1α)，Calpastatin(CAST).The results indicated that the IMF contents in the dorsal and abdominal muscles of the Schizothorax Prenanti were significantly higher than those of other fishes，and the shear force of the dorsal and abdominal muscles was significantly lower than that of other three fishes.The expression level of H-FABP and PGC-1α in dorsal and abdominal muscles of the Schizothorax Prenanti was the highest，while the expression level of PPARγ and H-FABP was the lowest.The lowest expression level of CAST was also found in the dorsal and abdominal muscles of the Schizothorax Prenanti.The results provide important

Schizothorax prenanti；Ctenopharyngodon idellus；Cyprinus carpio；Hypophthalmichthys molitrix；IMF；shear force；gene expressionreference data for elucidating the molecular mechanism of meat quality of the Schizothorax Prenanti.

Q7；Q959.4

A

2095-4271(2016)04-0393-06

10.11920/xnmdzk.2016.04.005

2016-03-23

赵燕英(1981-)，女，汉族，湖北襄阳人，副教授，博士，研究方向:基因功能验证.E-mail:biozyy＠163.com

林亚秋(1976-)，女，教授，博士.E-mail:linyq1999＠163.com

四川省应用基础项目(2014JY0088)；国家自然科学基金(31201990)