TLR9、MyD88及NF-κB在过敏性紫癜中的表达及意义

王子威　杨丽君

首都医科大学附属北京友谊医院儿科，北京100050

TLR9、MyD88及NF-κB在过敏性紫癜中的表达及意义

王子威杨丽君

首都医科大学附属北京友谊医院儿科，北京100050

目的探讨免疫上游因子TLR9、MyD88、NF-κB及免疫下游细胞因子IL-6、TNF-α在HSP组与正常对照组间的差异及相关性。方法采用实时荧光定量PCR检测HSP患儿外周血单核细胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表达量，ELISA法检测血浆IL-6、TNF-α水平。结果①HSP患儿外周血单核细胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表达均显著高于正常对照组；②HSP组血浆IL-6、TNF-α水平较对照组水平显著增高；③HSP组中TLR9与MyD88、TLR9与NF-κB、MyD88与NF-κB、NF-κB与IL-6以及NF-κB与TNF-α均存在线性正相关关系。结论HSP患儿TLR9、MyD88、NF-κB、IL-6、TNF-α水平均较正常儿童显著升高。TLR9-MyD88-NF-κB信号通路参与HSP发病，并在其中起重要作用。

过敏性紫癜；Toll样受体9；髓样分化因子88；核转录因子Kappa-B；白介素6；肿瘤坏死因子α

过敏性紫癜（henoch-schonlein purpura，HSP）是儿童时期最常见的免疫系统疾病，本病以小血管炎症为主要病变，好发于3～10岁儿童，常累及皮肤、胃肠道、关节、肾脏等多个系统，其发病率呈逐年增多趋势，临床上无有效的治疗措施及控制其进展的有力手段，近年来，人们努力寻找HSP发生的上游机制，随着Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）等模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）深入研究，人们发现这种形式让机体不但可以发现入侵的病原体，而且能够识别其类型，并通过一系列信号途径活化效应分子，从而控制并清除病原体。目前研究发现由Toll样受体9（Toll like receptor 9，TLR9）-髓系分化因子（myeloid differentiation factors 88，MyD88）-核转录因子Kappa-B（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通道介导下游细胞因子如血清白介素6（Interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）释放发挥免疫应答，因此信号通道TLR9-MyD88-NF-κB在免疫识别、激活、效应过程中发挥关键作用。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2015年3月～2016年3月首都医科大学附属北京友谊医院门诊及住院急性期HSP患儿40例作为研究对象，另选取我院儿童保健科健康体检儿童35例作为正常对照组。研究对象入选标准：①年龄＜14岁；②均为初诊初次发病，病程在3 d内且未接受治疗者；③HSP的诊断标准参照诸福棠《实用儿科学》第7版[1]；④近1个月内无感染及过敏性疾病史，未使用过激素及免疫抑制剂。对照组：选取同期在本院体检的正常健康儿童。本研究取得入选对象监护人知情同意并获我院医学伦理委员会批准。HSP组男21例，女19例，年龄3～12岁，平均（7.4±2.9）岁，对照组男18例，女17例，年龄3～11岁，平均（7.6±2.7）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法

实时荧光定量（real-time quantitative RT-PCR）检测：采集研究对象的组织，采用Trizol抽提法提取总RNA，按照反转录试剂盒（TAKARA公司）说明书合成cDNA。引物的设计使用Oligo 6.0设计软件设计，由上海生物工程有限公司合成，引物序列及扩增长度详见下图。RT-PCR使用TAKARA公司的SybergreenIMix试剂盒，反应条件为：94℃5 min，94℃15 s，58℃15 s，72℃15 s，共35个循环，扩增反应完成后又进行了溶解曲线的制作，确保扩增的特异性。

引物序列如下：

TRL9引物序列：

上游：5’-GGGACCTCGAGTGTGAAGCA-3’199

下游：5’-CTGGAGCTCACAGGGTAGGAA-3’

MyD88引物序列：

上游：5’-GCACATGGGCACATACAGAC-3’239

下游：5’-TGGGTCCTTTCCAGAGTTTG-3’

NF-κB引物序列：

上游：5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’197

下游：5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’

β-actin引物序列：

上游：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’111

下游：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’

血清IL-6、TNF-α由第四军医大学免疫学教研室提供ELISA试剂盒测定。敏感度为100μg/L，酶标仪MicroplateReader为美国Bio-Rad公司产品，在450 nm处读出吸光度（A）值，操作严格按说明书进行。

1.3统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计分析，数据经正态分布检验后，满足正态分布的计量资料以（±s）表示，计量资料组间比较采用t检验，直线相关性分析应用Pearson分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HSP组与正常对照组血浆IL-6与TNF-α表达水平比较

HSP组血浆IL-6、TNF-α水平较对照组水平显著增高，差异有高度统计学意义（t=5.11、9.26，P＜0.01）。见表1。

表1　HSP组与正常对照组血浆IL-6与TNF-α水平比较（±s）

表1　HSP组与正常对照组血浆IL-6与TNF-α水平比较（±s）

组别n IL-6（ng/mL）TNF-α（pg/mL）HSP组正常对照组t值P值40 35 41.85±7.59 33.90±5.53 5.11 0.00 0.83±0.16 0.49±0.15 9.26 0.00

2.2HSP组与正常对照组人外周血单个核细胞（peripheralblood mononuclearcell，PBMC）TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表达量比较

HSP患儿外周血单核细胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表达均显著高于正常对照组，差异有高度统计学意义（t=5.68、5.42、112.95，P＜0.01）。见表2。

表2　HSP组与正常对照组PBMC TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表达量比较（s）

表2　HSP组与正常对照组PBMC TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表达量比较（s）

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2.3HSP组中TLR9与MyD88，TLR9与NF-κB，MyD88与NF-κB，NF-κB与IL-6以及NF-κB与TNF-α的相关关系

HSP组中TLR9与MyD88，TLR9与NF-κB，MyD88与NF-κB，NF-κB与IL-6以及NF-κB与TNF-α均存在线性正相关关系。TLR9与MyD88呈正相关（r=1.00，P＜0.01）；TLR9与NF-κB呈正相关（r= 0.98，P＜0.01）；MyD88与NF-κB呈正相关（r=0.98，P＜0.01）；NF-κB与IL-6呈正相关（r=0.98，P＜0.01）；NF-κB与TNF-α呈正相关（r=0.97，P＜0.01）。

3　讨论

过敏性紫癜是儿童好发的自身免疫系统疾病，目前发病率逐年上升，发病率约为万分之一[2]。临床上以非血小板减少性皮疹、腹痛、关节痛、血尿和蛋白尿为主要表现，可分为单纯皮肤型、关节型、腹型、肾型、混合型[3]。

Toll样受体是目前研究较多的一种模式识别受体，至少包括13个成员（TRL1-13），其中TRL1-9在人类及小鼠中均有表达，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要的作用，实现对入侵病原体的早期识别，激活天然免疫，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁[4，5]。TLR9是TLRs家族中的一员，能识别细菌和病毒DNA中非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序（CpG-DNA），在微生物、空气传播的细菌、真菌、病毒病原菌感染的先天免疫中起作用。启动炎性应答信号通路，成为近两年HSP研究的热点[6]。TLR9信号通道是MyD88依赖通道[7]。

MyD88通过一系列信号分子如：Toll/IL-1受体同源区（Toll/IL-1 receptorhomologous region，TIR）、白介素1受体相关蛋白激酶（IL-1 Rassociated kinase，IRAK）4、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNFR-associatedfactor 6，TRAF6）、TGF-β激酶（TGF-βactivated kinase 1，TAK1）和TAK1结合蛋白（TAK1 binding protein，TAB），最终激活NF-κB[8]，促进下游炎性因子如白介素1（Interleukin 1，IL-1）、白介素6（Interlenkin 6，IL-6）、白介素8（Interleukin 8，IL-8）、白介素12（Interleukin 12，IL-12）和TNF-α等表达。

TLR9-MyD88-NF-κB信号通道激活后能启动下游多种炎症因子的转录和合成[9]。大量研究发现，包括细菌、病毒以及其他病原体的感染与HSP的发病最为密切，机体受到病原微生物感染后，激活上游TLR9-MyD88-NF-κB信号通道后，活化的NF-κB诱导下游多种炎症因子和酶等基因的表达，介导瀑链式炎症反应的形成、发展及恶化。国外Maria E等[10]通过研究63例HSP患儿与50例正常儿童外周血单核细胞，发现在HSP患儿外周血中TLR9 mRNA表达远远高于正常组。Coppo R等[11]研究发现HSP患儿中TLR9基因和蛋白表达较正常组均显著升高，故推测TLR9信号通路介导HAP异常免疫反应。Alper S等[12]发现TLRs通过IL-1和NF-κB途径引起炎症反应。TLR信号通路的上调还与肾脏疾病有关，在国外一项HSP研究中，野生型C57BL/6实验鼠和TLR缺失型实验鼠同时接种同等剂量的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），野生型C57BL/6实验鼠发生严重过敏性紫癜肾炎，表现为肾小球血栓，新月体形成和肾小球巨噬细胞浸润，而TLR缺失型实验鼠却未发生过敏性紫癜肾炎，研究表明TLR信号通路在过敏性紫癜肾炎发生及发展过程中起到重要作用[13]。Hong C等[14]2011～2013年将105名HSP患儿按照24 h尿蛋白量分成3组，A组诊断为HSP，但未见肾脏损伤，B组HSP伴有肾脏损伤，但无大量蛋白尿，C组HSP伴有肾脏损伤，合并大量蛋白尿，同时以35例健康儿童作为健康组，研究发现C组患儿TLR9 mRNA和蛋白表达远远高于对照组，同时比A、B组均高，研究还发现TLR9表达与24 h尿蛋白定量呈线性相关关系。这个结论与Maria E[10]得出在成人中，TLRs表达与蛋白尿的量有很明显的相关性的结论，高度一致。故本研究推测TLR4异常激活与HSPN发生有密切相关。目前越来越多的研究表明TLR信号通路参与了HSP发病的过程[15-18]。因此HSP的发病与TLR9-MyD88-NF-κB信号通道密切相关。TNF-α和IL-6均属于免疫下游细胞因子，研究表明NF-κB是其上游的调控点。

本实验发现HSP组患儿TLR9、MyD88、NF-κB均比正常对照组患儿明显升高，差异有统计学意义，三者间经过统计学分析具有线性正相关关系，说明HSP患儿因内源性或外源性因素机体免疫上游的TLR9、MyD88、NF-κB被激活，同时我们也检测到免疫下游细胞因子IL-6、TNF-α在HSP组比正常对照组明显升高，且与上游的TLR9、MyD88、NF-κB存在线性正相关关系。因此在HSP发病过程中，TLR9-MyD88-NF-κB信号通道作为上游信号受到外界刺激被活化后，继而引起下游炎症介质，包括自由基，细胞因子，前列腺素类和补体级联反应，打破机体的免疫耐受，导致HSP的发病。

因此如果对免疫反应上游的TLR9或MyD88进行干预，是否可减轻HSP症状或进行早期预防，这将是我们下一步研究的重点。

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Expression and significance of TLR9,MyD88 and NF-κB in HSP

WANG Ziwei YANG Lijun
Department of Pediatrics,Beijing Friendship Hospital Affiliated to Beijing Capital University,Beijing 100050,China

Objective To investigate the differences and correlations of immunological upstream factors of TLR9, MyD88,NF-κB and immunological downstream factors of IL-6 and TNF-αin the HSP group and normal control group.Methods The expression of TLR9,MyD88 and NF-κB in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of HSP were detected by real-time PCR.The levels of IL-6 and TNF-αwere measured by ELISA.Results①The expression of TLR9,MyD88 and NF-κB mRNA in peripheral blood mononuclear cells of children with HSP was significantly higher than that of normalcontrols；②The levels of IL-6 and TNF-αin plasma of HSP group were significantly higher than those in the control group；③There was a positive linear correlation between TLR9 and MyD88,TLR9 and NF-κB, MyD88 and NF-κB,NF-κB and IL-6,NF-κB and TNF-αin HSP group.Conclusion The levels of TLR9,MyD88, NF-κB,IL-6 and TNF-αin children with HSP are significantly higher than those in normal children.TLR9-MyD88-NF-κB signal pathways play an important role in the pathogenesis of HSP.

HSP；TLR9；MyD88；NF-κB；IL-6；TNF-α

R554.6

A

1673-9701（2016）29-0009-04

（2016-08-07）