调控CD147基因表达的Micro RNA分子鉴定及其抗膀胱癌转移研究

徐刚　薛义军▲　邹晓峰　李龙滨　袁源湖　肖日海　邹毓华

1.赣南医学院第一附属医院泌尿外科，江西赣州341000；2.江西省赣州市南康区第一人民医院泌尿外科，江西赣州341400

调控CD147基因表达的Micro RNA分子鉴定及其抗膀胱癌转移研究

徐刚1薛义军1▲邹晓峰1李龙滨2袁源湖1肖日海1邹毓华1

1.赣南医学院第一附属医院泌尿外科，江西赣州341000；2.江西省赣州市南康区第一人民医院泌尿外科，江西赣州341400

目的探讨调控CD147基因表达的MicroRNA对膀胱癌的增殖、迁移和浸润的关联性。方法选取自2015年1月～2016年5月在我院接受治疗的膀胱癌患者50例，分别取膀胱癌组织以及癌旁组织采用免疫组化进行CD147阳性检测，构建CD147 siRNA重组腺病毒（Ad-CD147 siRNA）载体转染膀胱癌细胞，将CD147阳性表达的膀胱癌组织随机分为Ad-CD147 siRNA转染的干扰组，腺病毒颗粒转染的阴性对照以及未加处理的对照组，采用MTT检测肿瘤细胞增殖能力、采用划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力、采用明胶酶谱实验检测MMP-2和MMP-9含量、采用Transwell小室法检测肿瘤细胞浸润能力。结果CD147在膀胱癌组中阳性率90.00%（45/50）显著高于癌旁组织12.00%（6/50），差异有统计学意义（P＜0.05）。不同性别和不同年龄间CD147阳性表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而不同的TNM分期及肿瘤细胞分化程度与CD147阳性表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。空白组及对照组的膀胱癌细胞迁移距离、侵入基底胶数量、MMP-2以及MMP-9含量明显高于干扰组，体外膀胱癌细胞在490 nm处吸收值显著低于干扰组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论CD147基因所表达的MicroRNA能够通过促进MMP-2和MMP-9的分泌而加速膀胱癌组织的血供形成，加速增殖、迁移以及浸润。

CD147基因；微小RNA；小RNA；肿瘤转移；膀胱癌

膀胱癌是较为常见的发生于泌尿系统的死亡率较高的恶性肿瘤[1]，由于人们的生活方式改变以及工作压力的升高，使膀胱癌发病率呈现上升趋势，再加上其较高的病死率，使该病逐渐受到重视。虽然其能够通过相应检查手段早期发现并手术治疗，但仍然无法取得理想的治疗效果。膀胱癌患者最主要的死亡原因是肿瘤发生迁移和浸润，因此有效地控制膀胱癌细胞迁移和浸润是延长患者寿命的关键。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子[2-3]（extracellular metalloproteinase inducer，EMMPRIN/CD147）是广泛存在于肿瘤细胞表面的一种单向跨膜糖蛋白，与肿瘤的迁移和浸润有着密切的联系。近年来，参与肿瘤迁移和浸润密切相关的因子MMP-2与MMP-9受到广泛的研究，且有人猜测其与CD147基因所分泌的MicroRNA有一定联系。因此本文旨在探讨调控CD147基因表达的MicroRNA对膀胱癌的增殖、迁移和浸润的关联性。现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2015年1月～2016年5月来我院接受治疗的膀胱癌患者50例，其中男34例，女16例，年龄23～62岁，平均（49.8±8.5）岁，所有患者均初次患病，且为原发，无远处转移，所有患者均经过病理活检，并由2名以上病理医师评定结果，取50例患者膀胱癌组织以及癌旁组织制成组织芯片待检，将其按照原发灶淋巴结远处转移（Tumor Node Metastasis，TNM）分期分为T1（13例）、T3（17例）和T4期（20例）。低分化21例，中分化18例，高分化11例。将CD147阳性表达的膀胱癌组织随机分为Ad-CD147 siRNA转染的干扰组、腺病毒颗粒转染的阴性对照以及未加处理的对照组各15例。

1.2方法

1.2.1采用免疫组化检测CD147阳性表达通过标本收集与储存，抗原修复后进行免疫组化，现用现配3%透明胶质酸（haluronic acid，HA），密封20 min，蒸馏水PBS洗，山羊血清密封1 h，继续用PBS缓冲液进行三次洗涤，滴加由上海拜力生物科技有限公司生产的即用型快捷免疫组化MaxVision试剂，湿盒中室温静置，对待测样品通过石蜡做包埋，将样品与石蜡结合待凝固后应用石蜡切片机将待测组织切成4μm厚度芯片，将组织芯片置于65℃恒温中5 h待测。

1.2.2采用MTT法检测增殖能力吸取膀胱肿瘤细胞于培养基中，先后加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），0.25%的胰蛋白酶溶解液，显微镜观察合格后加入10%胎牛血清制成细胞悬液，滴入载玻片上进行计数，分析三组细胞的增殖情况。

1.2.3划痕实验检测膀胱癌细胞迁移能力首先进行癌细胞培养，随后采用PBS进行冲洗，加入1 mL EDTA消化，脱壁后终止消化，制成细胞悬液800 r/min，5 min离心，过夜培养后，观察细胞贴壁情况，根据不同分组向其中加入不同干扰物培养48 h，采用移液枪枪头进行划痕实验，观察肿瘤细胞迁移情况。

1.2.4明胶酶谱法观察MMP-2和MMP-9含量配置分离胶和浓缩液，采用移液枪加液后，进行电泳，110 V电泳至溴酚蓝指示剂前到达分离胶前端左右时停止电泳，观察跑胶条带的宽度、面积以及灰度值。

1.2.5Transwell肿瘤细胞侵袭实验制作底胶后，在每个小室内加入趋化剂，小心将转染的细胞悬液加入小室内，观察侵袭情况。

1.3统计学方法

对本次研究对象所得的数据聘请专业的卫生统计学人员应用软件SPSS13.0进行相关的处理与分析，对数值变量资料间的样本均数比较一般采用t检验，用（±s）表示，对多组分类变量的率的比较一般采用卡方检验，如若P＜0.05，则说明两变量之间或多变量间差异显而易见。如若进行SNK-q检验。对两个变量间的相关性进行研究时，可先进行正态性检验，若结果满足正态，可对其先进行χ2检验判断两变量间是否相关独立，如若P＜0.05则说明两变量间相关联。

2　结果

2.1CD147在不同组织中的表达情况

CD147在膀胱癌组织中的阳性率[90.00%（45/50）]显著高于癌旁组织[12.00%（6/50）]，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　CD147在不同组织中的表达情况[n（%）]

2.2CD147在膀胱癌组织不同病理特征中的阳性表达情况

不同性别和不同年龄间CD147阳性表达差异无统计学意义（P＞0.05）；而不同的TNM分期以及肿瘤细胞分化程度的CD147阳性表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3CD147 siRNA对膀胱肿瘤细胞的迁移、侵袭以及增殖能力的影响

空白组以及对照组的膀胱癌细胞迁移距离、侵入基底胶数量、MMP-2以及MMP-9含量明显高于干扰组，体外膀胱癌细胞在490 nm处吸收值显著低于干扰组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示CD147与膀胱癌细胞迁移，侵入及增殖有一定联系。见表3。

表2　CD147在膀胱癌组织不同病理特征中的阳性表达情况[n（%）]

3　讨论

CD147是一种存在于肿瘤细胞表面的基质蛋白酶诱导因子[4-6]，属于单次跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。有研究显示[7-10]，该因子多表达于肿瘤组织以及炎症反应组织中，同时在精子分化过程中也有参与。膀胱癌是泌尿系统内常见的恶性肿瘤之一，其具有较高的迁移和浸润能力，是导致患者死亡的主要原因。因此了解膀胱癌迁移和浸润的机制有助于膀胱癌的治疗和控制，但膀胱癌的迁移和转移是个复杂的反应过程。有研究报道[11-13]，CD147能够在一定程度上协助癌细胞转移，在CD147协助转移途径中，MMP-2以及MMP-9起决定性作用。

RNA干扰现象[14]（RNA interfering，RNAi）是指通过干扰性小RNA（siRNA）特异性地降解目标RNA，使其沉默不表达，是近年来常用的研究基因功能的方法。因此，本文旨在通过siRNA探讨调控CD147基因表达的MicroRNA分子鉴定及其抗膀胱癌转移作用。

本次研究结果显示，CD147在膀胱癌组中阳性率（90.00%）显著高于癌旁组织（12.00%），说明CD147对于肿瘤组织具有一定特异性；结果显示而不同的TNM分期以及肿瘤细胞分化程度与CD147阳性表达，差异具有统计学意义（P＜0.05），进一步说明CD147与肿瘤组织的增殖分化具有一定联系。2010年，陈清标等[15]研究了CD147在膀胱癌组织中表达的情况发现，膀胱癌组织中CD147表达率为70.7%，显著高于正常膀胱组织以及癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05），与本研究结果基本一致。空白组以及对照组的膀胱癌细胞迁移距离、侵入基底胶数量、MMP-2以及MMP-9含量明显高于干扰组，体外膀胱癌细胞在490 nm处吸收值显著低于干扰组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示CD147与膀胱癌细胞迁移、侵入以及增殖有一定联系，可能是由于MMP-2和MMP-9在发生迁移和浸润的肿瘤细胞中呈高度表达，且二者高表达的肿瘤细胞迁移率高达92.3%，MMP-2具有降解基底膜屏障、促进血管内皮因子（VEGF）的生成、加速肿瘤内新生血管形成，为肿瘤增殖、迁移以及浸润提供可能；MMP-9是肿瘤血管再生的开关，其能够启动血管生成，因此CD147通过作用于MMP-2和MMP-9，从而为肿瘤增殖、侵入以及迁移提供条件。

综上所述，CD147是肿瘤组织中特异表达因子，能够为肿瘤的增殖、迁移以及侵入提供条件，为膀胱癌的转移以及浸润的控制以及治疗提供新的思路和方法。

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表3　CD147 siRNA对膀胱肿瘤细胞的迁移、侵袭以及增殖能力的影响（±s）

表3　CD147 siRNA对膀胱肿瘤细胞的迁移、侵袭以及增殖能力的影响（±s）

注：*与干扰组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）

组别n干扰组对照组空白组F值P迁移距离（mm）侵入基底胶数量（个）490 nm处吸收值MMP-2（μg/mL）MMP-9（μg/mL）15 15 15 0.82±0.01 1.62±0.04*1.88±0.04*245.77＜0.05 80.24±8.54 211.58±9.63*259.34±10.27*576.36＜0.05 0.58±0.14 0.48±0.11*0.30±0.08*12.25＜0.05 0.41±0.03 0.83±0.06*0.87±0.06*40.23＜0.05 0.17±0.02 0.81±0.05 0.82±0.06 90.55＜0.05

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Study on the identification of MicroRNA molecule in regulating CD147 gene expression and its anti-bladder cancer metastasis

XU Gang1XUE Yijun1ZOU Xiaofeng1LI Longbin2YUAN Yuanhu1XIAO Rihai1ZOU Yuhua1
1.Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,China；2.Department of Urology,the First People's Hospital of Nankang District of Ganzhou City in Jiangxi Province,Ganzhou 341400,China

Objective To investigate the correlation of MicroRNA that regulates the expression of CD147 gene with the proliferation,migration and infiltration of bladder cancer.Methods A total of 50 patients with bladder cancer who were treated in our hospital from January,2015 to May,2016 were selected,and immunohistochemistry was used to detect the positive expression of CD147 in bladder cancer tissues and adjacent tissues,and vector-transfected bladder cancer cells of CD147 siRNA recombinant adenovirus(Ad-CD147 siRNA)were constructed.CD147 positive bladder cancer tissues were randomly divided into interference group transfected with Ad-CD147 siRNA,negative control group transfected by adenovirus particles,and untreated control group.MTT was used to detect the proliferation of tumor cells,the migration ability of tumor cells was detected by scratch test,the contents of MMP-2 and MMP-9 were detected by gelatin zymography,and tumor cell infiltration ability was measured by Transwell chamber method.Results The positive rate of CD147 in bladder cancer group was 90.00%(45/50),which was significantly higher than that in para-cancerous tissue(12.00%,6/50).The difference was statistically significant(P＜0.05).There was no significant difference of CD147 expression between different genders and ages(P＞0.05).The expression of CD147 was significantly different between T stage and tumor cell differentiation(P＜0.05).The migration distance,invasion matrix quantity,MMP-2 and MMP-9 of bladder cancer cells in blank group and control group were significantly higher than those in the interference group, and the absorbance of bladder cancer cells at 490 nm was significantly lower than that in the interference group,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion MicroRNA expressed by CD147 gene can accelerate the formation of blood supply,accelerate proliferation,migration and infiltration of bladder cancer by promoting the secretion of MMP-2 and MMP-9.

CD147 gene；MicroRNA；Small RNA；Tumor metastasis；Bladder cancer

R737

A

1673-9701（2016）29-0001-03

江西省赣州市指导性科技计划项目▲

（2016-08-09）