酿酒酵母总蛋白的提取及其耐核苷类药物表达特性分析

魏红岩， 孟晓卿， 黄志伟

(东华大学 化学化工与生物工程学院, 上海 201620)



酿酒酵母总蛋白的提取及其耐核苷类药物表达特性分析

魏红岩， 孟晓卿， 黄志伟

(东华大学 化学化工与生物工程学院, 上海 201620)

建立了一种简便适用于从真核细胞酿酒酵母菌中提取总蛋白的方法，应用该方法探索了两株对核苷类药物5-FC高耐受菌株的蛋白表达特性。实验中以细胞破碎率和总蛋白浓度为主要检测指标，对比分析了6种酵母细胞破碎方法，即液氮研磨、超声波破碎、酸洗玻璃珠法、酶法、反复冻融法、TNBIO高压细胞破碎，通过比色法测定了总蛋白的含量，发现改进后的酸洗玻璃珠法的细胞破碎率为81.25%，总蛋白含量152.67 mg/mL，效果明显优于其他几种方法. 实验表明,在裂解液中添加适量的PMSF等蛋白酶抑制剂，可以有效防止蛋白的降解。经过SDS-PAGE对核苷类药物高耐药性菌株酵母总蛋白表达特性分析，酸洗玻璃珠法提取的蛋白含量高，所含杂质少，条带比较多且清晰，其中相对分子质量约为21 kDa和43 kDa的蛋白有明显的表达差异，可能与菌株细胞的耐药性相关。

酿酒酵母； 细胞破碎； 蛋白质提取； 耐药性

0 引 言

酵母广泛应用于遗传和细胞生物学的研究，也是基因工程技术应用中十分重要的宿主菌[1]。由于酵母细胞具有坚硬的细胞壁，其厚度约为0.1～0.3 μm，当细胞老化时，厚度还会增加，难以破碎[2]，导致酵母细胞中的总蛋白的释放率不高。对酵母细胞进行破碎，是对细胞内物质提取和研究中的关键步骤，也是综合利用酵母的一种有效途径，在一定程度上决定着实验的成功与否及效率高低[3]。目前，虽已有多种方法应用于酵母细胞的破碎，但仍存在不少弊端。例如：传统的机械操作方法易产生高温，损耗大[4]；酶裂解法成本高，易造成产物抑制，且酶解后分离繁琐；化学法作用时间长、效率低，并且所用试剂毒性较大，特别是化学法对蛋白质的损伤较大，容易引起蛋白质变性，且引入的化学试剂为实验的后续处理带来了困难；超声波法产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活，且散热困难[5]；高压破碎过程中，团状或丝状真菌易造成堵塞以及有些亚细胞器质地坚硬易损伤机器等[6]。以往研究人员一直致力于如何提高细胞破碎率，增加所需蛋白的提取率，却缺乏在提高细胞破碎率的同时，对总蛋白损坏和降解的研究。本文对适用于酵母的破碎方法进行了一些优化探索。

核酸药物是以核酸为作用靶点的药物，干扰或阻断细菌、病毒和肿瘤细胞的核酸合成，有效地杀灭或抑制细菌、病毒和肿瘤细胞[7]。5-氟胞嘧啶(5-FC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)是当前应用最广泛的核酸类抗真菌药物，但由于其相关药物细胞毒副作用大且易于产生耐药性，是临床使用的重要障碍。酵母是研究药物或化合物作用机制的极好单细胞模型[8]。本文利用本实验室拥有的5-FC高耐受菌株BY4741R1-5FC和 BY4741R2-5FC，结合改进的酿酒酵母总蛋白的提取方法，对酵母耐核苷类药物表达特性进行分析，为进一步开展临床真菌核苷类药物耐药性的研究提供基础。

1 材料方法

1.1 材 料

酿酒酵母S.cerevisiaeBY4741(MATα; his3△1; leu2△0; met15△0; ura3△0 )；抗性菌株BY4741R1-5FC(BYR1-5FC); BY4741R2-5FC(BYR2-5FC)，由本实验室提供。

1.2 主要试剂

YPD液体培养基(2% Tryptone，2% Glucose，1% Yeast extract)；酵母完全合成(SC)固体培养基(0.17% Yeast Nitrogen Base，0.12% Glutamic Acid，0.2% Drop-outMix，1.5% Agar，2% Glucose)；裂解缓冲液: 8 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，1% (w/v) 二硫苏糖醇(DTT)，1 mmol/L 苯甲酰磺酰氟(PMSF)，1 mmol/L NaF,35 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，DTT、PMSF、NaF临用前再加；牛血清蛋白(BSA)；蜗牛酶；浓HCl；牛血清白蛋白(Bovine Albumin，BSA)均为分析纯；10% SDS；四甲基乙二胺原液(TEMED)； 30% 丙稀酰胺；5×电泳液缓冲液；10% 过硫酸胺(AP)；1.0 mol/L Tris·HCl(pH6.8)；磷酸盐缓冲液；1.5 mol/L Tris·HCl(pH 8.8)；PageRulerTMPrestained Protein Ladder。

1.3 主要仪器

高速离心机，UV-2100 紫外分光光度计，超声波细胞粉碎机，TNBIO高压细胞破碎机，Tanon-3500凝胶成像系统，玻璃珠(Sigma，0.3 mm)，涡旋振荡仪,OLYMPUS BX53F相差显微镜,佳能 EOS600D，垂直蛋白电泳仪。

2 试验方法

2.1 酵母细胞的培养

酵母细胞接种于50 mL YPD液体培养基中培养，160 r/min，30 ℃培养48 h，在600 nm处测定菌液的光密度(Optical Density，OD)，使OD值达到OD600≈3。分别取4 mL菌液低温离心收集菌体。

2.2 物理方法

(1) 酸洗玻璃珠法。参照文献[9-10]方法并适当修改。向离心管中加入1 mL含有蛋白酶抑制剂[PMSF]和[NaF]的裂解缓冲液和一定量的过夜酸洗玻璃珠(2/3处)，混匀后于旋涡振荡仪上振荡30 s，冰浴30 s，重复60 次，在离心管底部扎孔，放入新的离心管中，4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，收集上清液。

(2) 液氮研磨法。参考文献[11]方法。向离心管中加入4 mL裂解缓冲液，振荡混匀后，冰浴20 min。将研钵、杵、药匙事先液氮预冷，研磨时注入液氮，期间需常补充液氮以保证研磨过程始终在液氮中进行。反应结束后, 12 000 r/min 离心10 min，收集上清液。

(3) 超声波破碎法。参考李聪等[12]超声破碎的参数并做适当调整。收集菌体，将超声破碎仪探头置于离心管液面下约1 cm处，在冰浴条件下进行超声破碎。超声条件为500 W，时间间隔(工作时间∶间歇时间)3∶3(s/s)，工作30 min，超声完后12 000 r/min 离心10 min，收集上清液。

(4) 反复冻融法。按照岳洪霞等[13]报道的方法。向离心管中加入4 mL裂解液缓冲液，振荡混匀，于-20 ℃冷冻处理20 min, 然后置于沸水浴20 min, 依次循环3次,12 000 r/min离心10 min，收集上清液。

(5) TNBIO高压细胞破碎法。参考文献[14]的方法。向离心管中加入4 mL裂解液缓冲液，振荡混匀后，在功率0.75 kW, 压力150～180 MPa的条件下, 经25 s一次性破碎，12 000 r/min离心10 min，收集上清液。

2.3 化学方法

参考贾艳萍等[15]操作条件并做适当调整。向离心管中加入4 mL裂解液缓冲液和20 mg/mL的蜗牛酶,振荡混匀后,处理30 min，反应结束后, 12 000 r/min离心10 min，收集上清液。

2.4 破碎率检测的计算[19]

采用活菌显微镜直接计数法：

式中：α为酵母细胞的破碎率;A1为破碎前的酵母菌细胞计数结果；A2为破碎后的酵母菌细胞计数结果。将破碎前后的细胞悬液分别稀释至适当倍数后，在显微镜下观察计数完整细胞数，通过计算得到细胞破碎率，每组统计3 次，取平均值。

2.5 蛋白质含量的测定

采用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量[5]。以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白，磷酸盐缓冲液为空白，在A280 nm处测定OD，根据OD值与蛋白含量之间的线性关系测定蛋白质含量。所有操作步骤均在室温状态完成。

2.6 SDS-PAGE电泳

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，5.0% 浓缩胶(pH6.8)和10% 分离胶(pH8.8),上样量为每孔300 μg蛋白。取一定体积实验样品和Marker上样，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为120 V。电泳结束后,进行G-250染色。

3 结果与分析

3.1 酵母细胞破碎前后数量的观察和计数

采用相差显微镜(OLYMPUS BX53F) 对破碎前后的酵母菌混悬液进行细胞完整性观察，如图1所示。用细胞计数板对单位体积完整细胞计数。采用活菌显微镜直接计数法算出不同处理细胞破碎率，评价不同方法处理酵母细胞裂解效率。不同破碎方法处理样品细胞破碎率分别为：反复冻融法(44.59±4.49)%，超声波破碎法(67.21±1.43)%，酸洗玻璃珠法(81.25±0.91)%，高压破碎法(57.69±6.96)%，液氮研磨法(50.3±4.06)%，酶法(53±3.37)%。可知，酸洗玻璃珠法对酵母的细胞破碎率(81.25±0.91)%，比其他5种方法效率都高，反复冻融法细胞破碎率(44.59±4.49)%，其效率最低，其他依次为超声波破碎法>高压破碎法>酶法>液氮研磨法。酸洗玻璃珠法操作简便，样品间不会交叉污染，不需要高压设备，期间低温提取过程有利于蛋白充分溶解。采用高压细胞破碎仪破碎酵母，实验过程中样品损失较多。

(a)破碎前(b)破碎后

图1 细胞破碎效果检查和计数(×100)

3.2 不同细胞破碎法对提取样品中总蛋白含量影响

建立蛋白含量标准曲线，然后测定待测样品溶液的A280 nm值，参照标准曲线方程计算待测样品蛋白的含量。

由图2可知，在酵母细胞中，6种细胞破碎方法提取的总蛋白含量分别是液氮研磨法为68 mg/mL，超声波破碎法125.67 mg/mL，酸洗玻璃珠法152.67 mg/mL，酶法132.67 mg/mL，TNBIO高压破碎法111.67 mg/mL，反复冻融法40.67 mg/mL，其中酸洗玻璃珠法提取的蛋白含量最高，酶法相比于超声波破碎法和高压破碎法蛋白含量较高，可能是前者处理过程中有大量的酶蛋白的参入，而酶法破碎需要更长的时间才对细胞破碎有效果。通过测定280处吸光值, 可间接反映细胞中总蛋白的释放情况以及酵母细胞的破碎程度，结合各种方法细胞破碎率结果，确定酸洗玻璃珠法作为在后续实验中提取酵母细胞蛋白的的方法。

1-液氮研磨法, 2-超声波破碎法, 3-酸洗玻璃珠法,4-酶法, 5-TNBIO高压细胞破碎法, 6-反复冻融法

图2 不同破碎方法对样品提取液总蛋白含量的影响

3.3 酵母耐5-FC菌株蛋白表达特性的分析

酿酒酵母野生型菌株BY4741、抗性菌株BY4741R1-5FC和 BY4741R2-5FC经过一系列的稀释(10倍)滴到含有不同浓度5-FC的SC培养基上，对照为不加药的SC培养基，于30°C培养48～72 h。如图3所示，100 μg/mL的5-FC处理已经是野生型菌株BY4741的致死浓度，而对抗性菌株BY4741R1-5FC和BY4741R2-5FC处理浓度达到200 μg/mL时其仍生长良好，表现极高的耐药性。

图3 酵母耐5-FC菌株对药物胁迫敏感性表型

(a)蛋白酶抑制剂添加组(b)蛋白酶抑制剂未添加组

(c) 蛋白质电泳扫描图谱

图4 酿酒酵母耐5-FC菌株蛋白表达特性的SDS-PAGE电泳分析

酵母野生型菌株BY4741、5-FC抗性菌株BY4741R1-5FC和 BY4741R2-5FC经过24 h培养后，取OD600=8的细胞，用添加酶抑制剂和不添加酶抑制剂的裂解缓冲液分别进行酸洗玻璃珠法提取细胞总蛋白，测定样品蛋白的含量，添加蛋白酶抑制剂组的总蛋白含量平均值为120 μg/mL，明显比未添加组(蛋白含量平均值为50 μg/mL)高。样品经SDS-PAGE凝胶电泳分析,如图4(a)与4(b)所示，改进后提取样品蛋白条白更多且清晰，说明添加酶抑制剂可以有效减少总蛋白的降解。应用凝胶成像图像分析系统对野生型菌株和抗性菌株总蛋白的三维泳道图分析，如图4(c)，可以更明显地看出，抗性菌株21 kDa相对分子质量的蛋白相比于野生型被上调，而43 kDa的蛋白被下调，并且在图4(a)中43 kDa处的蛋白条带比野生型菌株的条带弱，也说明此处其对应蛋白基因的表达被下调。

4 结 语

实验室制备少量的细胞抽提物(<5 mL) 时，机械破碎是最适宜的方法，能够得到活性较高的产物[20]。对比分析了液氮研磨、超声波破碎、酸洗玻璃珠法、反复冻融法、TNBIO高压细胞破碎和破壁酶裂解法。结果显示，酸洗玻璃珠震荡提取法效果最好，特别是破碎处理过程中加入适量的蛋白酶抑制剂，如PMSF、NaF可有效保护提取蛋白质，提高提取物的蛋白含量，所含杂质少。用改进后的方法研究了酵母耐5-FC菌株蛋白表达特性，与对照相比，21 kDa和43 kDa的蛋白有明显的表达差异，可能与菌株细胞的耐药性相关。结果将为真菌生物全蛋白提取、表达特性、耐药性研究提供借鉴。

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Extraction of Total Protein fromSaccharomycesCerevisiaeand Analysis of Expression Characteristics for Resistant Nucleoside Drug

WEIHong-yan,MENGXiao-qing,HUANGZhi-wei

(College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China)

The purpose of this study was to obtain a simple method of total protein extraction from eukaryotic cells ofSaccharomycescerevisiae. By using this method, the protein expression characteristics of two strains highly resistant to nucleoside drug 5-FC were investigated. In this study, the cell breaking rate and total protein concentration were used as the main indexes to compare and analyze the six yeast cellular breaking methods, including liquid nitrogen grounding, ultrasonic lysis, acid glass beads, enzymatic disruption, freeze-thaw, TNBIO high pressure cell cracker. We found that the breaking rate of the modified acid glass beads reached 81.25%, and the total protein content was 152.67mg/mL. It indicated that this method was the best among the six ones. In addition, the experiment showed that the protease inhibitors like PMSF were properly added to the solution, can better prevent the degradation of the total protein. By using SDS-PAGE, the total protein expression of two yeast strains highly resistant to nucleoside drug 5-FC was analyzed. The result showed that the protein content was high and impurities were less, and the protein bands were more and clearer with the method of acid glass beads. Compared to the untreated control, the expressions of proteins about 21 kDa and 43 kDa were significantly different in the resistant cells. It is suggested that these proteins may be related to the high drug resistance. The results will provide reference for the studies of the total protein extraction, expression characteristics and drug resistance of fungi.

Saccharomy cescerevisiae; cell disruption; protein extraction; drug resistance

2015-11-02

中央高校基本科研业务费专项资金项目(2232014A3-03)；上海市自然科学基金项目(15ZR1400200)

魏红岩(1989-)，女，甘肃兰州人，硕士生，主要研究方向为抗真菌药物对酿酒酵母的作用机制及相关技术的研发工作。

Tel.: 18909445124; E-mail.: qq985472678@163.com

黄志伟(1972-)，男，山东临沂人，副教授，硕士生导师，主要研究方向为以动物细胞和酵母作为模式材料，从事药物遗传、遗传网络机制及化合物毒理机制。

Tel.:021-67792911; E-mail.: zhiweih@ dhu.edu.cn

Q 816

A

1006-7167(2016)08-0040-04