钩藤提取物对MPTP诱导帕金森病模型小鼠神经元的影响

卢芳，井月娥，任燕冬，张淑香，刘树民

1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.佳木斯医学院，黑龙江 佳木斯 154000

钩藤提取物对MPTP诱导帕金森病模型小鼠神经元的影响

卢芳1，井月娥1，任燕冬2，张淑香1，刘树民1

1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.佳木斯医学院，黑龙江 佳木斯 154000

目的 探讨钩藤提取物对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导帕金森病（PD）模型小鼠神经元保护的作用机制。方法 将C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、钩藤组及美多芭组，腹腔注射MPTP法制备PD小鼠模型。行为学测试小鼠抓握和肢体运动协调能力；生化法测定小鼠中脑黑质超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）水平，酶联免疫法测定白细胞介素（IL）-1β、IL-6的活性。结果 与对照组比较，模型组小鼠自主活动次数减少、爬杆时间延长（P＜0.05），脑组织SOD、GSH-Px酶活性明显下降，MDA、IL-1β、IL-6含量明显上升（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，钩藤组和美多芭组小鼠自主活动次数增多、爬杆时间缩短（P＜0.05），脑组织SOD、GSH-Px酶活性明显上升，MDA、IL-1β及IL-6含量明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。结论 钩藤提取物对PD模型小鼠的治疗作用可能是通过清除氧自由基、提高机体抗氧化能力和抑制炎症反应，从而减少神经元的凋亡实现的。

帕金森病；钩藤提取物；神经保护；小鼠

帕金森病（Parkinson disease，PD），亦名震颤性麻痹，是一种常见的慢性神经系统退行性疾病，以静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓和姿势反射性受阻为典型临床特征，并通常伴有精神障碍、认知障碍或睡眠障碍，导致患者失去生活能力。目前对于PD的发病机制并未明确的界定，多巴胺/乙酰胆碱等神经递质失调、氧化应激、免疫炎性机制等因素被认为参与了中脑黑质部位神经元的病变。对于PD的临床治疗，全球范围内普遍以西药治疗为主，而“金药物”美多芭也仅能改善患者的症状，无法阻止疾病的发展进程[1]，且服用西药通常会出现一系列的不良反应，所以，寻求一种中药保护制剂迫在眉睫。钩藤为茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤或无柄果钩藤的干燥带钩茎枝。已有研究显示钩藤对于PD患者症状具有改善作用[2]。本研究从钩藤提取物入手，检测在氧化应激反应中起重要作用的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）3项指标，以及神经炎症过程中2种重要的细胞因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6来探讨钩藤提取物对神经元保护的作用机制，为开发预防或治疗PD的新药提供参考。

1 实验材料

1.1 动物

健康C57BL/6雄性小鼠32只，2月龄，体质量（20±2）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于黑龙江中医药大学药物安全性评价中心动物实验室，饲养温度（22±1）℃、湿度（60±5）%，自由饮食、饮水。

1.2 药物

钩藤药材购于黑龙江省药材公司，经黑龙江中医药大学刘树民教授检验符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。水浴温度80 ℃，70%乙醇提取2次，加醇量分别为10、8倍，提取时间分别为2、1.5 h。合并滤液，60 ℃真空旋至浸膏，最后冷冻干燥得钩藤提取物。多巴丝肼片，上海罗氏制药有限公司，批号SH1778。

1.3 主要试剂与仪器

钩藤碱（成都普菲德生物技术有限公司，批号150515）、异钩藤碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号111927-201403），羧甲基纤维素钠（天津市凯通化学试剂有限公司），1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP，美国Sigma公司），SOD、MDA、GSH-Px测试盒和IL-1β、IL-6酶联免疫试剂盒，南京建成生物工程研究所。Waters2695高效液相色谱仪（日本岛津），ZZ-6小鼠自主活动测试仪（成都泰盟），KDC-160HR高速冷冻离心机（科大创新），UV-2450可见分光光度计（日本岛津）。

2 实验方法

2.1 色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-水（60∶40）含10 mmol/L三乙胺，乙酸调pH值7.5；流速：1 mL/min；测定波长：254 nm；在所拟色谱条件下，钩藤碱的理论塔板数不低于1500。精密称取钩藤碱或异钩藤碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含50 μg溶液，即得对照品溶液。取钩藤总碱20 mg，用甲醇溶解后滤过，25 mL定容，即得供试品溶液，进样量20 μL，测定钩藤总碱中钩藤碱和异钩藤碱的含量。经HPLC检测，自提的钩藤提取物中钩藤碱含量为0.13%、异钩藤碱含量为0.18%，色谱图见图1。

图1 异钩藤碱、钩藤碱HPLC图

2.2 分组、造模及给药

参照文献[3]腹腔注射MPTP法制备C57BL/6小鼠PD模型。将小鼠随机分为对照组、模型组、钩藤组及美多芭组，每组8只。适应性喂养1周后，造模组予MPTP腹腔注射30 mg/（g•d），连续5 d，制备PD小鼠模型，对照组腹腔注射等量生理盐水。造模结束后，钩藤组予钩藤提取物混悬液灌胃，根据前期药效学实验选择最佳剂量818 mg原药材/（kg•d）；美多芭组予多巴丝肼片悬浊液0.12 mg/g灌胃；模型组和对照组予等量羧甲基纤维素钠混悬液灌胃。给药体积0.1 mL/10 g体质量，1次/d，连续20 d。

2.3 行为学测试方法

各组小鼠于实验前1周每日进行1次爬杆、自主活动行为训练，于取材前进行爬杆和自主活动实验检测其抓握能力和肢体运动协调能力。爬杆实验：将一直径为2.5 cm泡沫塑料小球固定于一根60 cm长1 cm粗铁杆顶端，杆上缠绕医用胶带以防打滑。将小鼠放至球顶，松手的同时开始计时，记录小鼠落到地面的时间。自主活动实验：将小鼠放到自主活动仪内，适应黑暗环境3 min，然后开始计时5 min，记录小鼠规定时间内的活动次数。

2.4 脑组织匀浆液制备

行为学测试后，将各组实验小鼠于冰上断头取脑，将黑质部位置于冻存管中，液氮速冻并于-80 ℃冰箱保存。MDA、SOD样品制备：准确称取小鼠脑组织质量，按质量（g）∶体积（mL）＝1∶9比例加9倍生理盐水，冰水浴条件下，机械匀浆，制备成浓度为10%匀浆液，3000 r/min离心10 min，取上清液分装待测。GSH-Px样品制备：取上述10%样品匀浆液，用生理盐水稀释成1%样品待测。IL-1β、IL-6样品制备：准确称取小鼠脑组织质量，按质量（g）∶体积（mL）＝1∶9比例加9倍体积PBS（pH 7.4），冰水浴条件下，机械匀浆，制备成浓度为10%匀浆液，3000 r/min离心20 min，收集上清液，分装待测。

2.5 指标检测

取已制备好的相应浓度样品，实验按照各试剂盒说明书进行操作。SOD、MDA、GSH-Px样品采用生化法测定，分别以分光光度计于550、532、412 nm处，1 cm光径比色杯，双蒸水调零，比色。IL-1β、IL-6样品采用酶联免疫法测定，于酶标仪波长450 nm处测定光密度（OD）值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 一般状况

实验开始2 d后，造模小鼠逐渐开始出现头部和前肢不自主抖动、颈部和背部体毛战栗、活动减少现象，提示PD小鼠模型成功。小鼠在连续腹腔注射MPTP 5 d内体质量呈下降趋势。

4.2 行为学测定结果

与对照组比较，模型组小鼠自主活动次数减少、爬杆时间延长（P＜0.05）；与模型组比较，钩藤组和美多芭组小鼠自主活动次数增多、爬杆时间缩短（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组小鼠自主活动次数和爬杆时间比较（±s）

表1 各组小鼠自主活动次数和爬杆时间比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 只数 自主活动/（次/5 min） 爬杆时间/s对照组 8 72.14±13.88 6.5±1.38模型组 8 60.57± 8.40 9.0±1.79*钩藤组 8 74.57± 9.41#6.4±0.55#美多芭组 8 70.00±14.50 5.8±1.61##

4.3 钩藤提取物对模型大鼠脑组织超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽-过氧化物酶、白细胞介素-1β和白细胞介素-6水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠脑组织SOD、GSH-Px酶活性明显下降，MDA、IL-1β、IL-6含量明显上升（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，钩藤组和美多芭组小鼠脑组织SOD、GSH-Px酶活性明显升高，MDA、IL-1β、IL-6含量明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组小鼠脑组织SOD、MDA、GSH-Px、IL-1β及IL-6水平比较（±s）

表2 各组小鼠脑组织SOD、MDA、GSH-Px、IL-1β及IL-6水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 只数 SOD/（U/mg） MDA/（nmol/mg） GSH-Px/（U/mg） IL-1β/（ng/g） IL-6/（pg/g）对照组 8 115.13±10.58 0.87±0.16 13.49±1.35 20.49±3.79 11.69±3.39模型组 8 80.29± 8.18**1.47±0.16**11.24±1.25*29.49±4.63*15.52±0.92*钩藤组 8 113.61±12.12##1.20±0.13#14.14±2.44#22.01±3.26##12.28±1.84##美多芭组 8 115.00±10.93##1.13±0.02#13.26±1.58#17.91±6.38#11.49±0.99##

5 讨论

氧化应激学说认为，多巴胺氧化代谢产物造成细胞内氧化压力过盛和细胞抗氧化能力不足是PD黑质多巴胺能神经元自发退变的主要原因。GSH-Px、SOD均是体内重要的自由基清除剂，可有效清除H2O2及O2–等自由基。MDA含量也可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映细胞损伤的程度。本实验结果显示，模型组小鼠脑组织GSH-Px酶活性明显低于对照组（P＜0.05），MDA含量明显升高（P＜0.01），而清除O2–的抗氧化酶SOD酶活性显著降低（P＜0.01），经给予钩藤提取物和美多芭治疗后，MDA含量有所下降（P＜0.05）、SOD酶活性增强（P＜0.01），均向对照组水平靠近，GSH-Px酶活性升高（P＜0.05）。本实验结果表明，PD模型小鼠黑质内GSH-Px含量下降及抗氧化自由基酶类活性的改变都体现了经MPTP诱导后，小鼠脑组织清除自由基的功能明显不足，而给予药物治疗后，各项指标均被改善，提示钩藤提取物可通过清除氧自由基、增强机体抗氧化能力及减少细胞凋亡的途径保护神经元。

氧化应激除发生在神经元，也发生在神经胶质细胞。胶质细胞的激活，尤其是小胶质细胞的激活，是PD病理的重要组分[4]。小胶质细胞是脑内重要的免疫细胞，当受到外界刺激时会被激活而分泌一系列的细胞因子，其中IL-1β是炎症反应过程中最早被动员的细胞因子，它还可以激活巨噬细胞等分泌IL-6。在PD患者尸检中，黑质纹状体系统内明显可见主要分布在激活的小胶质细胞上的IL-1β等炎症因子，且炎症因子的表达与多巴胺神经元的丢失呈正相关[5]。IL-1β、IL-6均是炎症反应的中心环节，且同时具有免疫调节、抗炎、保护神经元、促进神经元修复等作用[6]。本实验结果显示，造模后模型小鼠黑质内IL-1β、IL-6的含量明显升高（P＜0.05），经钩藤提取物治疗后，二者含量显著下降（P＜0.01）。钩藤提取物能够通过抑制MPTP诱导的PD模型小鼠IL-1β、IL-6的表达，提示其可能通过阻断或减弱PD黑质神经胶质细胞的炎症反应来减少神经元的变性。

综上所述，钩藤提取物对MPTP诱导PD模型小鼠的神经保护作用是通过清除氧自由基、提高机体抗氧化能力及抑制神经炎症反应而实现的。

[1] HATTINGEN E, MAGERKURTH J, PILATUS U, et al. Phosphorus and proton magnetic resonance spectroscopy demonstrates mitochondrial dysfunction in early and advanced Parkinson's disease[J]. Brain,2009,132(12)：3285-3297.

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[4] QIAN L, FLOOD P M, HONG J S. Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and prime target for therapy[J]. J Neural Transm,2010,117(8)：971.

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[6] 王玖飞,王坤.炎性细胞因子在大鼠缺氧缺血性脑损伤中含量变化及其意义[J].黑龙江医药科学,2008,31(3)：8-9.

Effects of Uncariae Ramulus Cum Uncis Extract on Neurons of MPTP-induced PD Model

Mice

LU Fang1, JING Yue-e1, REN Yan-dong2, ZHANG Shu-xiang1, LIU Shu-min1(1. Heilongjiang University of

Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2. Jiamusi Medical College, Jiamusi 154000, China)

Objective To study the neuron protection mechanism of Uncariae Ramulus Cum Uncis extract for the MPTP-induced PD mice. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into control group, model group, Uncariae Ramulus Cum Uncis extract group and madopar group, and injected with MPTP in abdominal cavity. Behavior test was used to detect grabbing capacity and body movement coordination capacity: three biochemical indexes (SOD, MDA, GSH-Px) were detected by biochemical process and the activity of two immune enzyme-linked indexes (IL-1β, IL-6) were detected by enzymelinked immunosorbent assay. Results Compared with the control group, the autonomic activity numbers of mice increased and climbing pole time decreased in the model group (P<0.05), enzymatic activity of SOD and GSH-Px decreased significantly and the contents of MDA, IL-1β and IL-6 increased obviously (P<0.01). Compared with model group, the autonomic activity numbers of mice increased and climbing pole time decreased in the Uncariae Ramulus Cum Uncis extract group and madopar group (P<0.05). Enzymatic activity of SOD and GSH-Px increased and the contents of MDA and IL-1β and IL-6 decreased (P<0.05, P<0.01). Conclusion Uncariae Ramulus Cum Uncis extract can reduce neuronic apoptosis PD mice, whose therapeutic action may be realized through eliminating oxygen free radicals, improving oxidation resistance and reducing inflammatory reactions.

Parkinson’s disease; Uncariae Ramulus Cum Uncis; neuroprotection; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.015

R285.5

A

1005-5304(2016)04-0057-04

2015-06-03）

（

2015-07-15；编辑：华强）

国家自然科学基金青年基金（81303249）；中国博士后科学基金（2013T60398）；博士后研究人员落户黑龙江科研启动资助基金（LBH-Q13160）；黑龙江中医药大学科研基金（2013jc01）

刘树民，E-mail：keji-liu@163.com