剪刀股总酚酸提取条件的优化及对小鼠缺血心肌的保护作用*

王 威， 许丽娟

(1.张家口市第三医院， 河北 张家口 075000； 2.张家口市第四医院， 河北 张家口 075000)



剪刀股总酚酸提取条件的优化及对小鼠缺血心肌的保护作用*

王 威1， 许丽娟2*

(1.张家口市第三医院， 河北 张家口 075000； 2.张家口市第四医院， 河北 张家口 075000)

目的： 优化剪刀股总酚酸的提取方法，观察剪刀股总酚酸对小鼠缺血心肌的保护作用。方法：通过正交试验优化剪刀股总酚酸的提取条件，并采用高效液相色谱法测定没食子酸、原儿茶酸、绿原酸的含量；选取昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组，模型对照组，阳性对照组，剪刀股总酚酸高、中、低剂量给药组共6组，采用异丙肾上腺素法制备心肌缺血小鼠模型，测定血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶MB(CK-MB)的活性及心肌中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量，并通过Nagar-Olsen染色观察小鼠心肌缺血损伤程度。结果：剪刀股总酚酸最佳提取条件为提取温度为70 ℃，液料比为10∶1，醇浓度为15%，提取90 min(30 min×3)；剪刀股总酚酸平均提取率为4.85%，RSD为1.988%；剪刀股中没食子酸、原儿茶酸和绿原酸分别在0.60～9.60、0.90～14.40、1.00～16.00 mg/L，与峰面积呈良好线性关系，平均回收率分别为97.27%、98.15%、97.17%(n=9)；与模型组相比，阳性对照组和剪刀股总酚酸(高、中剂量)组心肌缺血小鼠血清中LDH、CK-MB活性显著降低，心肌中SOD的活性升高，心肌MDA的含量降低(P<0.05)；Nagar-Olsen染色显示，高、中剂量的剪刀股总酚酸组及阳性对照组小鼠心肌缺血损伤红染面积明显减少。结论：剪刀股中总酚酸含量较高，剪刀股总酚酸对心肌缺血小鼠的心肌有一定保护作用。

心肌缺血； 异丙肾上腺素； 小鼠； 剪刀股； 总酚酸

剪刀股(IxerisdebilisA.Gray)是菊科苦荬菜属植物剪刀股全草，可全草入药，鲜用或晒干，具有清热凉血，利尿消肿的功效，内用于肺热咳嗽、喉痛、口腔溃疡、急性结膜炎、阑尾炎、水肿和小便不利，外用治乳腺炎、疮疖肿毒和皮肤瘙痒[1]。蒲明秋等[2]报道剪刀股提取物可对抗烟碱引起的致癌作用，马金萍等[3]报道其醇提物可显著提高脑缺血再灌注损伤后小鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。对剪刀股活性成分的研究仅见剪刀股总黄酮的提取及含量测定[4]，对剪刀股总酚酸提取工艺的研究尚未见报道。本研究采用超声辅助法提取剪刀股总酚酸，并采用异丙肾上腺素复制心肌缺血模型小鼠，观察剪刀股总酚酸对心肌缺血模型小鼠血清中肌酸激酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)及心肌组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)，为剪刀股的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

UV2800双光束紫外可见分光光度计(上海恒平科学仪器有限公司)，KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，FA1204B电子分析天平(上海精科天美贸易有限公司)，H-20R高速冷冻离心机(北京安必升科技发展有限公司)

1.2 试剂与药品

剪刀股采自河北省张家口市赤城县，由河北北方学院赵恒诚教授鉴定为正品。咖啡酸标准品购于中国食品药品检定研究院(批号110885-200102)，复方丹参片(芜湖张恒春药业有限公司，批号14081115)，盐酸异丙肾上腺素注射液(西南药业股份有限公司，批号20140812)，LDH、CK-MB、SOD及MDA测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。其他试剂均为国产分析纯，实验用水为三重蒸馏水。

1.3 实验动物

健康的成年昆明种小鼠(雌雄各半)，体质量22～30 g，购于河北北方学院实验动物中心，分笼饲养，室温18～25 ℃，自由摄食、饮水。

1.4 剪刀股总酚酸的提取

1.4.1 咖啡酸标准曲线绘制 称取60 ℃干燥至恒重的咖啡酸对照品1.45 mg于10 mL容量瓶，乙醇溶解、定容，即得咖啡酸对照品溶液(0.145 g/L)。分别移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于25 mL容量瓶中，加乙醇至5 mL，依照文献方法显色，用0.1 mol/L盐酸溶液定容，避光放置20 min。以相应试剂为空白，于736 nm 波长处测定吸光度[5]。

1.4.2 正交试验设计 在单因素试验的基础上，选取提取温度、液料比、乙醇浓度、提取时间4个因素，并各设置3个水平，以总酚酸提取率为测定指标，采用L9(34)正交试验设计，进行超声(40 kHz)辅助提取，优化总酚酸提取工艺。试验因素和水平见表1。

1.4.3 稳定性试验 精密吸取相同供试品溶液5份，每份1 mL，分别于室温放置0、2、4、6、8和10 h后，依“1.4.1”项下方法测定吸光度。

1.4.4 重现性试验 同一批样品5份，每份1 g，精密称定，加10倍量浓度为15%的乙醇，于70 ℃超声辅助提取90 min(每次30 min，共3次)，滤过并合并滤液，加热除去有机溶剂，加水定容至25 mL。精密吸取0.2 mL，依“1.4.1”项下方法测定吸光度。

表1 正交试验影响因素与水平

Tab.1 Factors and levels of the orthogonal design

因素水平123提取温度(℃)607080液料比(mL/g)10∶120∶130∶1乙醇浓度(%)152535提取时间(min)90(30×3)120(40×3)150(50×3)

1.4.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，按“1.4.1”项下方法，连续5次测定吸光度。

1.4.6 加样回收试验 取重现性试验所用的同批样品(已知含量6.14%)5份，每份1 g，精密称定，加入适量的咖啡酸对照品，按供试溶液制备方法制备溶液，依“1.4.1”项下方法测定吸光度。

1.4.7 含量测定 准确称取剪刀股药材3份，各1.0 g，按照选定的最优条件进行超声辅助提取，滤过并合并滤液，加热除去有机溶剂，加水定容至25 mL。取2 mL于25 mL容量瓶中，加水定容后，按照“1.4.1”项下方法计算总酚酸浓度，并计算提取率。

1.5 剪刀股中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸含量

1.5.1 溶液制备 精密称取没食子酸、原儿茶酸和绿原酸对照品适量，分别加10%甲醇配成各单一对照品储备溶液。精密吸取各单一对照品储备液适量于量瓶中，加10%甲醇定容，得没食子酸、原儿茶酸和绿原酸混合对照品溶液，浓度分别为9.60、14.40、16.00 mg/L。精密称定剪刀股药材粉末1.000 g，按照“1.4.7 含量测定”项方法提取，滤过，合并滤液，定容至100.00 mL，摇匀，0. 45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得剪刀股总酚酸供试品溶液。

1.5.2 色谱条件 色谱柱为Thermo ODS-2 Hypersil(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长286 nm，流速1 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL；流动相为乙腈-水(0.1%乙酸水溶液)，梯度洗脱条件：0～9 min，5%乙腈；9～16 min，5%～19%乙腈；16～24 min，25%乙腈；24～30 min，40%乙腈，维持3 min。

1.5.3 专属性试验 在“1.5.2”项色谱条件下，取没食子酸、原儿茶酸和绿原酸混合对照品溶液、剪刀股总酚酸供试品溶液及没食子酸、原儿茶酸和绿原酸阴性对照溶液10 μL进样。

1.5.4 线性范围考察 将上述混合对照品溶液适当稀释配制混合标准系列溶液，其中含没食子酸系列质量浓度分别为0.60、1.20、2.40、4.80、9.60 mg/L；原儿茶酸系列质量浓度分别为0.90、1.80、3.60、7.20、14.40 mg/L；绿原酸系列质量浓度分别为1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mg/L。在上述色谱条件下分别进样进行测定。

1.5.5 精密度考察 精密吸取剪刀股总酚酸供试品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样5次，测定没食子酸、原儿茶酸和绿原酸峰的面积。

1.5.6 稳定性考察 精密吸取供试品溶液在室温下放置，分别在 0、2、4、8、10 h进样10 μL，测定没食子酸、原儿茶酸和绿原酸峰面积。

1.5.7 重复性考察 精密称取样品粉末5份，每份1.000 g，按“1.5.1”项下方法平行制备成供试品溶液，分别进样10 μL进行测定。

1.5.8 加样回收率考察 取已知没食子酸、原儿茶酸和绿原酸含量的剪刀股样品9份，精密称定，精密加入没食子酸、原儿茶酸和绿原酸适量，按“1. 5. 1”项下方法操作，制备供试溶液，在上述色谱条件下分别进样进行测定，计算回收率。

1.5.9 样品测定 取剪刀股供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μL，记录色谱图，代入回归方程计算剪刀股供试品溶液中没食子酸、原儿茶酸和绿原酸的含量。

1.6 剪刀股总酚酸对心肌缺血小鼠血清CK-MB、LDH或心肌组织中MDA、SOD的影响

1.6.1 剪刀股总酚酸供试液的制备 采用正交设计确定的最佳提取条件，提取剪刀股总酚酸。取剪刀股总酚酸适量，加水溶解，配制为浓度为1 g/L的溶液，即为剪刀股总酚酸供试液。复方丹参片供试液(阳性对照)的制备 取复方丹参片若干片，加蒸馏水适量，室温超声助溶，制备为7 g/L(相当于饮片)的混悬液。

1.6.2 分组与给药 昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、剪刀股总酚酸高、中、低剂量给药组共6组，每组10只；3个剪刀股总酚酸组给药剂量分别为20、10以及5 mg/(kg·d)，阳性对照组腹腔注射复方丹参片混悬液7 mg/(kg·d)，正常对照组和模型对照组给予生理盐水10 mL/(kg·d)腹腔注射，每日下午4时注射，每日1次，连续注射11 d；注射第7 天开始，模型对照组、阳性对照组、剪刀股总酚酸高、中、低剂量给药组小鼠腹腔注射异丙肾上腺素0.02 g/(kg·d)，每日上午10时给药，每日1次，制备心肌缺血模型[6]。

1.6.3 观察指标 取材参考文献[7-8]。末次给药15 min后，断头处死小鼠并取血，迅速取心脏组织。每组8只小鼠心脏用生理盐水洗净，滤纸吸干，按试剂盒说明，分别测定心肌中SOD活性和MDA的含量。每组2只小鼠心脏置于4%多聚甲醛内固定，制心肌石蜡切片，Nagar-Olsen染色观察小鼠心肌缺血损伤程度。血液置于肝素化的塑料离心管中，3 500 r /min 离心15 min，分离血清，分别测定血清中LDH、CK-MB活性。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 剪刀股总酚酸的提取

2.1.1 咖啡酸标准曲线绘制 以咖啡酸浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，得回归方程A=0.689 6C+0.045 1(r=0.999 6)。表明咖啡酸标准溶液在0.58～2.9 mg/L范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

2.1.2 总酚酸提取率及其影响因素 由表2、表3可知，影响超声辅助提取剪刀股总酚酸得率的因素的主次顺序为提取温度>乙醇浓度>液料比>提取时间，其中提取温度和乙醇浓度对提取率的影响有显著性。最佳工艺条件为A2B1C1D1，即提取温度为70 ℃，液料比为10∶1，乙醇浓度15%，提取90 min。

2.1.3 稳定性 稳定性试验结果吸光度RSD=3.23%(n=5)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.1.4 重现性 重现性试验结果吸光度RSD=2.64%(n=5)，表明方法重现性好。

2.1.5 精密度 精密度试验结果吸光度RSD=0.15%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.1.6 加样回收率 平均加样回收率为97.5%，RSD为3.97%，表明方法具有良好的加样回收率。

2.1.7 剪刀股总酚酸含量 测定结果见表4。

表2 总酚酸提取率(正交试验)

Tab.2 Results of total phenolic acid extraction rate (orthogonal design)

注：A为提取温度，B为液料比，C为乙醇浓度，D为提取时间

表3 各因素对总酚酸提取率的影响

Tab.3 The effect of various factors on the extraction rate of total phenolic acid

因素偏差平方和自由度F比F临界值提取温度5.7932275.85719.000料液比0.05722.71419.000乙醇浓度1.651278.61919.000提取时间0.02121.00019.000误差0.022

表4 剪刀股总酚酸含量

Tab.4 Determination of content of total phenolic acid fromIxerisdebilisA.Gray

试验号总酚酸提取率(%)平均提取率(%)RSD(%)14.7424.894.851.98834.92

2.2 剪刀股中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸的含量

2.2.1 专属性试验 在“1.5.2”项色谱条件下，没食子酸、原儿茶酸和绿原酸混合对照品溶液及剪刀股总酚酸供试品溶液中 3种酚酸成分达到基线分离。没食子酸、原儿茶酸和绿原酸混合对照品、剪刀股总酚酸供试品及没食子酸、原儿茶酸和绿原酸阴性高效液相色谱法(HPLC)色谱图见图1。

2.2.2 线性范围 没食子酸、原儿茶酸和绿原酸在0.60～9.60、0.90～14.40、1.00～16.00 mg/L浓度范围内，线性关系良好，回归方程分别为：没食子酸Y=40.21X+3.121，r=0.999 6；原儿茶酸Y=30.09X+12.663，r=0.999 8；绿原酸Y=22.16X+8.344，r=0.999 2。

注：1为没食子酸，2为原儿茶酸，3为绿原酸；A为混合对照品溶液，B为剪刀股总酚酸供试品溶液，C～E为阴性对照品 (C缺没食子酸，D缺原儿茶酸，E缺绿原酸)

2.2.3 精密度 没食子酸、原儿茶酸和绿原酸峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为2.3%、2.5%、2.8%，结果表明精密度良好。

2.2.4 稳定性 没食子酸、原儿茶酸和绿原酸峰面积的 RSD 分别为1.9%、2.1%、2.3%，表明供试品溶液中上述成分室温放置10 h内稳定性良好。

2.2.5 重复性 没食子酸、原儿茶酸和绿原酸含量RSD分别为2.1%、2.4%、2.5%，结果表明重复性良好。

2.2.6 加样回收率 加样回收试验结果没食子酸、原儿茶酸和绿原酸平均回收率(n=9) 分别为96.01%、97.82%、95.33%，RSD 分别为2.1%、2.5%、2.4%。

2.2.7 样品含量 剪刀股供试品溶液中没食子酸、原儿茶酸和绿原酸的含量分别为1.140±0.015、 0.922±0.012和 0.467±0.005 mg/g。

2.3 剪刀股总酚酸对心肌缺血小鼠血清CK-MB、LDH或心肌组织MDA、SOD的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠血清中CK-MB及LDH水平显著升高，心肌中MDA含量显著升高，SOD活性明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组相比，阳性对照组及剪刀股总酚酸高、中剂量组血清中CK-MB及LDH 水平降低，心肌中MDA含量降低，SOD活性升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中剪刀股总酚酸高剂量组及阳性对照组MDA含量降低明显(P<0.01)。见表5。

Tab.5 Effects of total phenolic acids on serum CK-MB, LDH and myocardial MDA, SOD

分组血清CK-MB(U/L)LDH(U/L)心肌SOD(kU/g)MDA(mol/g)正常对照组200±66 352±64 7.52±0.371.34±0.22模型对照组1100±101(3) 1180±76(3) 4.51±0.14(3)5.95±0.27(3)阳性对照组590±89(1)890±56(1)7.52±0.42(1)2.76±0.34(2)剪刀股总酚酸 高剂量组550±76(1)593±65(1)6.10±0.44(1)2.89±0.32(2) 中剂量组600±94(1)710±71(1)6.00±0.35(1)3.33±0.36(1) 低剂量组950±79(1)900±82(1)5.92±0.33(1)4.10±0.21(1)

与模型对照组比较，(1)P<0.05,(2)P<0.01；(3)与正常对照组比较,P<0.05

2.4 小鼠心肌缺血损伤程度

光学显微镜下观察心肌石蜡切片可见，正常对照组心肌组织呈黄染，模型组缺血心肌呈红染。与模型组比较，剪刀股总酚酸高、中剂量组及阳性对照组心肌红染面积明显减少，黄染面积增多，剪刀股总酚酸低剂量组心肌组织大片红染，仅见小部分组织黄染。见图2。

3 讨论

CK-MB、LDH大量存在于心肌细胞的胞浆或线粒体中，是心肌酶学中的标志酶之一；脂质过氧化作用是众多心脑血管疾病的发病机制之一，当体内自由基过多时，能对细胞及组织产生伤害，心肌细胞破裂或细胞膜通透性增加，使 CK-MB，LDH等酶渗出，从而导致心肌缺血小鼠血清中酶活性升高，血清酶的升高，可作为心肌受损的酶学标志物[9]。在急性心肌缺血时，除了组织学上发生心肌坏死的病理学变化外，也伴随着心肌酶的漏出等生理生化方面的变化。

注：A为正常对照，B为模型对照，C为阳性对照组，D为总酚酸低剂量组，E为总酚酸中剂量组，F为总酚酸高剂量组

酚酸是一类含有酚环结构的有机酸，具有较强的生物抗氧化作用。因此，酚类物质可能是中药对心肌保护作用的物质基础之一[10-11]。酚酸的化学性质活泼，在提取过程中可能氧化分解，因此，在剪刀股总酚酸的提取过程中，提取温度过高，提取时间过长，均能够导致酚酸类物质的降解，从而减低酚酸类成分的提取率。本实验结果显示，提取温度和乙酸浓度对总酚酸提取率的影响较大，根据优化的工艺条件总酚酸得率较高。本研究结果还显示，剪刀股中酚酸含量较高，其酚酸能显著降低异丙肾上腺素致心肌缺血模型小鼠血清中LDH、CK-MB活性，提高心肌SOD的活性，并降低心肌MAD的含量，可显著减少缺血心肌的Nagar-Olsen红染面积。表明剪刀股总酚酸对异丙肾上腺素致心肌缺血小鼠的心肌具有明显的保护作用。

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草[M]. 上海：上海科学技术出版社， 1999：881.

[2] 蒲明秋，毛飞鹏. 蚕豆根尖细胞微核试验-剪刀股对抗烟碱引起遗传物质损伤的诱变效应[J]. 中国慢性病预防与控制， 1995(2)：89.

[3] 马金萍. 剪刀股醇提物对小鼠脑缺血再灌注损伤后心肌组织中SOD和GSH-PX含量的影响[J]. 现代中药研究与实践， 2015(3)：31-32.

[4] 马金萍，杨辉. 剪刀股总黄酮的提取与含量测定[J]. 西部中医药， 2015(7)：27-29.

[5] 于佳慧，刘谈，郭茂娟，等. 参麦注射液对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血的保护作用[J]. 天津中医药， 2014(6)：353-357.

[6] 陈燕霞，陈康，黎珊，等. 小驳骨中总黄酮、总酚酸含量测定及其抗氧化活性[J].江苏农业科学， 2014(4)：258-259.

[7] Wang ZB，Yang H, Guo CY. Protection of water extract from paeoniae radix rubra against myocardial ischemia in mice induced by isoproterenol[J]. Hebal Medicines, 2013(4): 223-224.

[8] 李翠芳，王文杰，祁涛，等. 丹红注射液对大鼠急性心肌缺血的影响[J]. 贵阳医学院学报， 2015(8): 856-859.

[9] 闫佳佳. 太白楤木皂苷及其活性单体对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 西安：第四军医大学， 2015.

[10]黄美艳，唐于平，尚尔鑫，等.当归-川芎药对不同制法与配比抗氧化活性相互作用研究[J]. 中国中药杂志， 2013(2): 234-238.

[11]牛子冉，徐晓娜，陈俞材，等.丹酚酸A对异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血的保护作用及其机制[J]. 中国药理学通报， 2015(12): 1667-1674.

(2016-07-03收稿，2016-10-21修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 刘 华

Optimization of Extraction of Total Phenolic Acid fromIxerisDebilisA. Gray and Its Protective Effect on Myocardial Ischemia in Mice

WANG Wei1, XU Lijuan2

(1.The3thHospitalofZhangjiakou,Zhangjiakou075000,Hebei,China; 2.The4thHospitalofZhangjiakou,Zhangjiakou075000,Hebei,China)

Objective: To optimize the extraction of total phenolic acid fromIxerisdebilisA.Grayand to explore its protective effect on myocardial ischemia induced by isoproterenol in mice. Method: The total phenolic acid extraction conditions fromIxerisdebilisA.Graywere optimized by orthogonal test, and HPLC method was adopted for the determination of gallic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid content. 60 Kunming mice were divided into 6 groups: normal control group, model control group, positive control group , low dose group, middle dose group and high dose groups. A mouse model of myocardial ischemia was prepared by the method of isoproterenol. The effect of total phenolic acid inIxerisdebilisA.grayon myocardial ischemia model was studied by measuring the activities of serum lactate dehydrogenase(LDH), serum creatine kinase MB(CK-MB), the activities of the superoxide dismutase(SOD) and the content of malondialdehyde(MDA) in myocardium. The degree of myocardial ischemic injury in mice was observed by Nagar-Olsen staining. Result: The best condition for extracting the total phenolicacid fromIxerisdebilisA.Graywas heating theIxerisdebilisA.Grayin 10 times(Volume/quality) alcohol(15%) at 70℃ for 90 (30×3) minutes. The average extraction yield of the total phenolic acid inIxerisdebilisA.Graywas 4.85% (RSD=1.988%). The contents of gallic acid, protocatechuic acid and chlorogenic acid inIxerisDebilisA.Grayshowed good linear relationships with the peak area in the ranges of 0.60～9.60, 0.90～14.40 and 1.00～16.00 μg/mL, respectively, and the average recoveries (n=9) were 97.27%, 98.15%, and 97.17%, respectively. Compared with the model group, the activities of LDH, CK-MB in serum and the content of myocardial MDA of mice in the positive control group and the total phenolic acid groups(high, middle dose) were decreased and the activities of myocardial SOD were increased. The results of Nagar-Olsen staining showed that the area of cardiac muscles injured by ischemia in the positive control group and the total phenolic acid groups(high, middle dose) were diminished significantly. Conclusion: The content of total phenolic acid inIxerisdebilisA.Grayis at a relatively high level, which has a protective effect on the myocardium of mice with myocardial ischemia.

myocardial ischemic; isoproterenol; mice；IxerisdebilisA.Gray; total phenolic acid

� E-mail:xulijuansyy@163.com

时间：2016-11-15 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.023.html

R285.5

A

1000-2707(2016)11-1301-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.014