pSUPER-IL-11-shRNA表达载体的构建与鉴定*

王 伟， 陈 雪， 钟兆铭， 储红映， 胡泽东， 程 瑞， 孙传政

(昆明医科大学第三附属医院 头颈外科， 云南 昆明 650118)



pSUPER-IL-11-shRNA表达载体的构建与鉴定*

王 伟， 陈 雪， 钟兆铭， 储红映， 胡泽东， 程 瑞， 孙传政**

(昆明医科大学第三附属医院 头颈外科， 云南 昆明 650118)

目的： 构建及测序鉴定重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA，检测其对甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)细胞株sw579 IL-11基因的沉默效应。方法:根据Genebank中IL-11 cDNA序列，设计并合成3对两端有酶切位点的特异编码IL-11shRNA序列的寡核苷酸链，退火成互补双链后与pSUPER.retro.puro质粒载体连接，转至大肠杆菌DH-5α菌株，挑取单个抗性克隆，提取质粒进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析，脂质体介导重组质粒转染ATC细胞株sw579，real-time PCR及ELISA检测其对靶基因IL-11的表达影响。结果:重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA酶切产物凝胶电泳结果显示，3个样本均为阳性重组质粒，测序鉴定3种重组质粒pSUPER -IL-11-shRNA序列正确，转染3种重组质粒后sw579细胞裂解液中IL-11 mRNA和细胞培养上清液中IL-11蛋白显著降低。结论:本研究成功构建重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA，为进一步探索IL-11在ATC进展中的作用奠定了基础。

甲状腺肿瘤； 白细胞介素-11； RNA，小分子干扰； 短发夹RNA； 质粒

甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)是人类恶性程度最高的肿瘤之一，占全部甲状腺癌的1%～5%，但致死率却占全部甲状腺癌的14%～50%，临床研究表明虽然甲状腺癌治疗方案不断改进和完善，但其确诊后中位生存期只有3～9个月，1年生存率约20%[1-3]，因此有必要探索新的治疗手段。IL-11属于IL-6家族，参与调控炎症反应和肿瘤形成[4]。最近研究发现IL-11高表达与肝细胞癌、胃腺癌预后呈负相关，并促进乳腺癌、子宫内膜癌、软骨肉瘤等实体肿瘤远处转移[5-7]。本课题组既往研究发现，ATC患者IL-11水平与预后呈负相关，与ATC远处转移正相关，推测IL-11在ATC进展中发挥了重要作用，因此有必要探索IL-11作为 ATC分子治疗靶点的价值[1]。RNA干扰是利用高度保守的双链小分子干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)诱发的基因沉默，阻断体内特异基因表达，可用于探索基因功能和恶性肿瘤的基因治疗[8-9]。本实验拟设计靶向IL-11的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，构建IL-11的shRNA真核表达载体，转染ATC细胞系sw579细胞，real-timePCR和ELISA技术检测其沉默效应，为进一步探索IL-11在ATC进展中的作用及其作为治疗ATC分子靶点的价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.2 方法

1.2.1IL-11 shRNA序列设计与合成 根据Genbank中目的基因IL-11序列，按shRNA的设计原则设计3个针对IL-11基因的shRNA序列[10]， Sh-IL11-1#-S序列为5′-GATCTCCGCATCTGTGCCTTATTTATTTCAAGAGAATAAATAAGGCACAGATGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-1#-AS序列为5′-AGCTTTTCCAAAAAGCATCTGTGCCTTATTTATTCTCTTGAAATAAATAAGGCACAGATGCGGA-3′；Sh-IL11-2#-S序列为5′-GATCTCCGCCTGGGCAGGAACATATATTCAAGAGATATATGTTCCTGCCCAGGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-2#-AS序列为5′-AGCTTTTCCAAAAAGCCTGGGCAGGAACATATATCTCTTGAATATATGTTCCTGCCCAGGCGGA-3′；Sh-IL11-3#-S序列为5′-GATCTCCGCTGGATGCTTGGGTAACTTTCAAGAGAAGTTACCCAAGCATCCAGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-3#-AS序列为5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTGGATGCTTGGGTAACTTCTCTTGAAAGTTACCCAAGCATCCAGCGGA-3′。行BLAST对比分析。构建3′端酶切位点之前加入Pol Ⅲ聚合酶终止信号TTTTT，以Loop(TCTCTTGAA)相连。两端分别加入酶切位点BamHI和Hind Ⅲ，交上海Invitrogen公司合成，同时做无关序列对照。

1.2.2 表达载体的构建 将已合成的3个shRNA寡核苷酸单链模板稀释至大约3 g/L。配制总体积50 μL的NEB buffer 3退火体系，正向引物1 μL，反向引物1 μL，10×缓冲液5 μL，双蒸水43 μL，混匀，离心后置于沸水中，缓慢退火至室温。取退火产物1 μL与pSUPER.puro.retro以TaKaRa DNA Ligation Kit中的Solution I连接后，16 ℃反应2 h，使退火产物与表达载体连接。取3种pSUPER-IL-11-shRNA连接产物42 ℃热转化至大肠杆菌DH-5α菌株，涂板，37 ℃恒温箱培养过夜，氨苄青霉素(100 mg/L)筛选后，各随机挑选1个经转化后的孤立菌落(编号#1、#2、#3)培养用天根质粒小提试剂盒少量提取纯化质粒DNA，1%琼脂糖凝胶电泳，并送上海Invitrogen公司测序。

1.2.3 细胞培养及转染 ATC细胞株sw579置于含10%小牛血清的DMEM培养基中，于37℃ 5% CO2的培养箱中培养。待细胞长至80%时按Lipofectamine 2000说明书，将重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA #1、#2、#3和空载质粒转染sw579细胞，48 h后更换有1.0 mg/L嘌呤霉素(puromycin)的培养基筛选7 d左右，挑取存活细胞形成的克隆并扩大培养成稳定表达的细胞株，分别编号为IL-11KD#1、IL-11KD#2、IL-11KD#3和NC。

1.2.4 检测IL-11 mRNA及蛋白表达水平 收集上述4种细胞，用Trizol裂解液裂解细胞并提取总RNA，按TakaRa公司试剂盒说明书逆转录得到cDNA, 以cDNA为模板进行real-timePCR分析，以GAPDH作对照。 收集细胞培养上清液，按IL-11 ELISA检测试剂盒(R&D)说明书检测上清液中IL-11蛋白浓度，并检测细胞总蛋白浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行数据处理，各组质粒对sw579细胞IL-11蛋白及mRNA表达的抑制效果用率表示,组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA的酶切鉴定

在作文教学中，“情”“理”“法”是写好作文的三大关键点，教师在作文教学中引领学生把握好这三个关键点，就能逐步征服作文教学这片“海洋”。

根据pSUPER.puro.retro载体的图谱，用EcoR I和Hind III对重组质粒进行双酶切，得到281 bp的小片段以及6 061 bp的大片段。阳性重组质粒酶切产物电泳显示在281 bp及6 061 bp处有条带。样本#1、#2、#3均为阳性重组质粒。见图1。

注：1、2、3分别为样本，#1、#2、#3，4为阳性对照

2.2 重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA测序

重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA测序结果显示各样品中插入序列与设计的3个IL-11 shRNA序列完全一致，未发现碱基错配及突变。说明构建表达IL-11shRNA的pSUPER-IL-11-shRNA真核表达载体可用于下一步沉默实验。见图2。

图2 重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA测序结果

2.3 转染重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA 的sw579细胞培养上清液中IL-11蛋白表达

IL-11KD#1、#2、#3 sw579细胞中IL-11蛋白表达量较NC组明显降低。IL-11KD#1、#2、#3细胞相对于NC组的抑制率分别为61%、70%和52%。见图3。

与NC组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01

2.4 转染重组质粒pSUPER-IL-11-shRNA 的sw579细胞裂解液中IL-11 mRNA表达

Real-time PCR方法检测转染各干扰载体后sw579细胞裂解液中IL-11 mRNA表达情况，结果显示IL-11KD#1、#2、#3中IL-11 mRNA表达水平较NC组明显下调，IL-11KD#1、#2、#3组相对于NC组的mRNA抑制率分别为86%、94%和70%，见图4。

与NC组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01

3 讨论

甲状腺未分化癌诊断时大约有20%～50%的患者已发生远处转移，预后极差，目前尚无公认治疗模式，因此积极探索ATC的发病和进展机制，寻找治疗ATC分子靶点对于改善患者预后至关重要[1-3,11-13]。既往研究发现ATC患者血小板计数以及促进血小板生成的IL-11水平均与患者预后呈负相关，且IL-11与ATC患者远处转移正相关，推测IL-11在ATC进展中发挥了重要作用，因此探讨IL-11作为ATC分子治疗靶点具有重要意义[1]。

RNA干扰及基因沉默现象首先由Fire等[14]提出，其机制是双链RNA被核酸酶切割成siRNA，后者与靶基因mRNA特异结合并降解，进而抑制该基因的表达及功能[15]。制备siRNA的方法常用的有体外化学合成和DNA载体细胞内表达siRNA。前者是将化学合成的siRNA瞬时转染进细胞，此法方便，无需构建载体等繁琐操作，但其表达随细胞传代而逐渐减弱，持续时间短，不适合长时间进行细胞功能实验。DNA载体细胞内表达siRNA为短发卡RNA表达载体法，通过DNA载体与靶序列重组后，稳定转染进细胞核；shRNA由一条RNA 单链自身折叠形成双链的茎，加上一条单链Loop环构成，在细胞内会被自动加工成21～23 bp的双链siRNA，它在细胞中可与靶基因的mRNA结合并降解靶基因mRNA，从而干扰其翻译形成蛋白质[16]，此法通过抗性基因的筛选从而获得持续干扰目的基因的细胞株，为长期的细胞实验提供基础。

本文以IL-11为靶基因，根据siRNA设计原则[10]，通过RNA二级结构分析，在其mRNA的不同靶位点设计了3条针对目的基因的shRNA序列，并成功克隆至pSUPER.retro.puro质粒中，经凝胶电泳和基因测序鉴定证实成功构建了3个shRNA的表达质粒。将构建成功的3个干扰质粒分别转染sw579细胞后，ELISA结果显示转染IL-11KD#1、#2、#3组的sw579细胞IL-11蛋白表达水平与mRNA表达水平均显著降低，其抑制IL-11表达的效率都超过了50%，有效地沉默了IL-11基因的表达，该细胞模型的成功构建，为进一步研究IL-11基因对甲状腺未分化癌生物学特性的影响及开展体内研究奠定了基础。

[1] Sun C, Li Q, Hu Z, et al. Treatment and prognosis of anaplastic thyroid carcinoma: experience from a single institution in china[J].PLoS One, 2013(8): e80011.

[2] HaymartMR, Banerjee M, Yin H, et al. Marginal treatment benefit in anaplastic thyroid carcinoma[J]. Cancer, 2013 (17):3133-3139.

[3] Segerhammar I, Larsson C, Nilsson IL, et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid gland: treatment and outcome over 13years at one institution[J]. J Surg Oncol, 2012(8):981-986.

[4] Onnis B, Fer N, Rapisarda A, et al. Autocrine production of IL-11 mediates tumorigenicity in hypoxic cancer cells[J]. J Clin Invest, 2013 (4): 1615-1629.

[5] Casimiro S, Luis I, Fernandes A, et al. Analysis of a bone metastasis gene expression signature in patients with bone metastasis from solid tumors[J].Clin Exp Metastasis, 2012(2):155-164.

[6] Lay V, Yap J, Sonderegger S, et al. Interleukin 11 regulates endometrial cancer cell adhesion and migration via STAT3[J].Int J Oncol, 2012 (2):759-764.

[7] Li TM, Wu CM, Huang HC, et al. Interleukin-11 increases cell motility and up-regulates intercellular adhesion molecule-1 expression in human chondrosarcoma cells[J]. J Cell Biochem, 2012 (11):3353-3362.

[8] Sibley CR, Seow Y, Wood MJ. Novel RNA-based strategies for therapeutic gene silencing[J]. MolTher, 2010 (3): 466-476.

[9] Gu Y, Hou W, Xu C, et al. The enhancement of RNAi against HIV in vitro and in vivo using H-2K(k) protein as a sorting method[J]. J Virol Methods, 2012(1-2):9-17.

[10] Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interference[J]. Nat Biotechnol, 2004(3):326-330.

[11] Ito K, Hanamura T, Murayama K, et al. Multimodality therapeutic outcomes in anaplastic thyroid carcinoma: improved survival in subgroups of patients with localized primary tumors[J]. Head Neck, 2012(2):230-237.

[12] Polistena A, Monacelli M, Lucchini R, et al.The role of surgery in the treatment of thyroid anaplastic carcinoma in the elderly[J].Int J Surg, 2014(Suppl 2):170-176.

[13] Onoda N, Kashiwagi S, Noda S, et al.High efficacy of chemoradiation therapy sensitized by weekly docetaxel for anaplastic thyroidcancer[J].Anticancer Res, 2013(8):3445-3448.

[14] Russo J, Harrington AW, Steiniger M.Antisense Transcription of Retrotransposons in Drosophila: An Origin of Endogenous Small Interfering RNA Precursors[J].Genetics, 2016(1):107-121.

[15] Olejniczak M, Urbanek MO, Jaworska E, et al.Sequence-non-specific effects generated by various types of RNA interference triggers[J].Biochim Biophys Acta, 2016 (2):306-314.

[16] Burroughs AM, Ando Y, Aravind L.New perspectives on the diversification of the RNA interference system:insights from comparative genomics and small RNA sequencing[J].Wiley Interdiscip Rev RNA, 2014 (2):141-181.

(2016-08-02收稿，2016-11-01修回)

中文编辑： 周 凌； 英文编辑： 刘 华

《贵阳医学院学报》更名启事

经国家新闻出版广电总局(新广出审〔2016〕267号文)批准，原《贵阳医学院学报》更名为《贵州医科大学学报》，国内统一连续出版物号由CN52-5012/R更改为CN52-1164/R，主管、主办单位变更为贵州医科大学，出版单位变更为《贵州医科大学学报》编辑部(为贵州医科大学内设机构)。其他登记项目不变。

特此公告

《贵州医科大学学报》编辑部

Construction and Identification of pSUPER-IL-11-shRNA

WANG Wei, CHEN Xue, ZHONG Zhaoming, CHU Hongying, HU Zedong, CHEN Rui, SUN Chuanzheng

(DepartmentofHeadandNeckSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To construct and identify pSUPER-IL-11-shRNA and detect the silencing effect of IL-11 gene of sw579 cell line of anaplastic thyroid carcinoma (ATC). Methods: According to IL-11 cDNA gene sequence in the Gene bank, three pairs of oligonucleotides with specific coding IL-11shRNA sequence, each containing the sites of restriction endonuclease at both ends, were designed and synthesized. After annealing, the complementary double strands were connected with pSUPER.retro.puro plasmid vector, which was transfected into DH-5α bacterial strain. The single resistance clone was collected. The plasmid was extracted and the recombinants were identified by 1% agarose gel electrophoresis, sequenced and analyzed. Liposome mediated recombinant plasmid was transfected into sw579 cell line of ATC, and real-time PCR and ELISA were adopted to detect its effect on the expression of target gene IL-11. Results: The results gel electrophoresis for enzyme-digested product showed that the pSUPER IL-11shRNA was successfully constructed. 3 samples were all positive recombinant plasmids, and the sequences of 3 recombinant plasmids of pSUPER-IL-11-shRNA were identified by sequencing. IL-11 mRNA in sw579 cell lysis solution and IL-11protein in cell culture supernatant of sw579 cells were significantly decreased after transfection of 3 recombinant plasmids. Conclusion: pSUPER-IL-11shRNA expression vector has been successfully constructed, and makes it possible to further explore the role of IL-11 in ATC.

thyroid neoplasm; interleukin-11; RNA， small molecule interference; short hairpin RNA; plasmid

国家自然科学基金(81560470,81260402); 云南省高层次卫生技术人员专项经费(D-201243); 云南省中青年学术技术带头人后备人才专项经费(2015HB086)

E-mail:scz008@126.com

时间：2016-11-15 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.014.html

R34-33； R736.1

A

1000-2707(2016)11-1269-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.007