兴义维蚋蚋卵(胚胎)原代培养细胞核型分析*

周 静， 刘占钰， 徐 旭， 崔立秋， 陈汉彬， 杨 明**

(1.贵州医科大学 生物与工程学院， 贵州 贵阳 550004； 2.赣南医学院第一附属医院 检验科， 江西 赣州 341000； 3.贵州医科大学附院 肝病实验室， 贵州 贵阳 550004； 4.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550004)



·专题研究1·

兴义维蚋蚋卵(胚胎)原代培养细胞核型分析*

周 静1， 刘占钰2， 徐 旭3， 崔立秋4， 陈汉彬4， 杨 明4**

(1.贵州医科大学 生物与工程学院， 贵州 贵阳 550004； 2.赣南医学院第一附属医院 检验科， 江西 赣州 341000； 3.贵州医科大学附院 肝病实验室， 贵州 贵阳 550004； 4.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550004)

目的： 分析兴义维蚋蚋卵(胚胎)原代培养细胞核型。方法：应用组织块法处理野外采集兴义维蚋蚋卵(胚胎)，以改良Shields and Sang M3为基础培养基，pH 6.0～6.5，置于28 ℃生化恒温培养箱中进行原代细胞培养，选取10个处于有丝分裂增殖时期的细胞，通过秋水仙素处理，制作中期染色体标本，进行核型分析。结果：显微镜下观察，前中期染色体为3对(2n=6)，染色体凝集程度未达最大化呈现长杆状，染色体长度为9.43～13.58 μm；中期染色体为3对(2n=6)，高度凝集呈现短杆状，染色体长度为2.43～4.67 μm，两条中期染色体臂比值<1.67，属中着丝粒染色体，4条染色体臂比值>1.67，属亚中着丝粒染色体。结论：初步阐析了兴义维蚋蚋卵(胚胎)原代培养细胞核型特征。

蚋科； 兴义维蚋； 胚胎； 原代细胞； 核型分析

蚋类，俗称黑蝇(blackflies)，是一类小型驼背的双翅目吸血昆虫，可在人类和禽畜中传播盘尾丝虫病(onchocerciasis)、禽鸟住白细胞虫病(Leucocytozoonsis)和水泡性口炎(vesicular stomatitis)等，严重危害人类和禽畜的健康和安全，对蚋类生态习性的研究对蚋类的生物防治具有重要的理论和临床意义。迄今，全球已知现生的2 151蚋种中，研究人员已对390种进行了细胞学研究[1-2]。蚋类细胞通过有丝分裂确保遗传物质传递，使得细胞分化和组织发生得以实现，确保了蚋虫的生长发育。对于蚋类原代细胞染色体的核型分析，可以丰富蚋类遗传学知识体系，指导蚋类分类系统研究，并为蚋类细胞系建立提供鉴定依据[3]。目前，国外学者对蚋类染色体在形态分类中的作用进行了研究[4-6]，国内学者主要对河南纺蚋、黑山水蚋和兴义维蚋等唾腺多线染色体进行研究[7-11]，这些研究主要是通过组织标本进行蚋类染色体研究，而对于蚋类细胞有丝分裂增殖过程中染色体的核型研究尚无相关报道。本研究以贵州省贵阳市郊区兴义维蚋蚋卵(胚胎)为研究材料，在适宜的细胞培养基和培养条件下对蚋卵(胚胎)组织进行原代细胞培养，选取处于增殖生长旺盛时期的原代培养细胞，制备原代细胞前中期和中期染色体，进行核型分析,以期为蚋类细胞系鉴定奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

用于原代细胞培养的组织均为蚋科前幼虫期卵块标本，从贵阳市郊区(花溪、羊昌、乌当)野外采集蚋卵(胚胎)，未发育至前幼虫期蚋卵可经蚋类槽式循环饲养系统处理，待其发育至前幼虫期(肉眼为棕黑色，镜下通过透明卵壳可见红眼点出现，破卵器形成)[1]，经鉴定为兴义维蚋后用于原代细胞培养。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养及观察 将野外采集的蚋卵(胚胎)从卵阀上分离，无菌水清洗4～5次进行消毒前预处理；70%乙醇浸泡10 min，无菌水冲洗2～3次；1%过氧乙酸浸泡15 min，无菌水冲洗3～4次；2.8% NaClO浸泡5 min，无菌水冲洗4～5次[12]。将消毒好的蚋(卵)胚胎吸入2 mL离心管中，眼科剪剪碎，加入1/2体积的0.25%胰蛋白酶，27 ℃处理10 min，纱布过滤，滤液800 r/min，离心5 min，去除上清，应用改良型Shields and Sang M3(20% FBS、500 U/mL青霉素、500 mg/L硫酸链霉素、12.5 mg/L两性霉素B、5 mg/L胰岛素)细胞培养基悬浮组织细胞并计数，按1×105个/mL，接种于经多聚赖氨酸 (PLL) 处理一次性塑料培养皿中，置于28 ℃生化恒温培养箱中培养。组织细胞悬液接种后，根据细胞生长情况，进行1/2、1/3及1/4部分换液，倒置显微镜下定期观察组织细胞的贴壁情况及细胞的迁移、增殖状态，并拍照分析。

1.2.2 原代细胞染色体制备 选取处于有丝分裂增殖期的原代培养细胞，秋水仙素培养处理5～6 h，KCl低渗处理2次，Carnoy’s固定液固定后置于载玻片上，姬姆萨染色，中性树胶封片。在40倍物镜下寻找背景干净、染色体分散较好的有丝分裂相，在100倍物镜下CCD获取染色体图像。选取染色体分散较好的10个分裂相细胞，进行染色体计数，测量染色体的长度，计算臂比值，对染色体进行分类[13]。统计分析各条染色体的相对长度，根据相对长度对染色体进行列队，排出核型图，进行核型分析[14-16]。

2 结果

2.1 原代细胞培养

根据细胞生长情况，定期对原代培养细胞进行换液处理。蚋卵(胚胎)组织块接种12 h后，组织细胞贴壁生长；培养1周，大量细胞从组织块周围脱落迁移生长。培养3周，可见圆形细胞有丝分裂为两个子代细胞(图1A)，细胞增殖较为明显(图1B)。该时期细胞增殖活跃，可作为蚋卵(胚胎)原代细胞核型分析材料。

2.2 核型分析

选取染色体分散较好的前中期或中期分裂相细胞共10个进行拍照，显示前中期染色体为3对(2n=6)，按照染色体长度进行编号排序，3对染色体分别以Ⅰ1、Ⅰ2，Ⅱ1、Ⅱ2，Ⅲ1、Ⅲ2进行编号，该期染色体长度为9.43～13.58 μm(表1)。中期染色体染色体为3对(2n=6)，染色体编号与前中期相同，该期染色体长度为2.43～4.67 μm，臂比值结果显示2条染色体为中着丝粒染色体，4条染色体为亚中着丝粒染色体(表2)。蚋卵(胚胎)原代细胞染色体核型模式图显示：前中期染色体未达最大化凝集呈现长杆状(图2A),染色体数目2n=6，按照染色体长度进行编号排序(图2B)；中期染色体高度凝集呈现短杆状(图3A)，按照臂比值可划分为中着丝粒和亚中着丝粒染色体，并对其进行编号排序，其中中着丝粒染色体2条、占总染色体数目的1/3，亚中着丝粒染色体4条、占总染色体数目2/3(图3B)。

表1 兴义维蚋蚋卵前中期染色体长度

Tab.1 The measurement of prometaphase chromosomes ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

染色体编号前中期染色体长度(μm)Ⅰ113.58Ⅰ213.46Ⅱ111.25Ⅱ210.47Ⅲ19.57Ⅲ29.43

表2 兴义维蚋蚋卵中期染色体绝对长度、相对长度、臂比值、染色体类型(x±s)

Tab.2 The statistics of metaphase chromosome ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

注：p为短臂，q为长臂，M为中央着丝粒，SM为亚中央着丝粒

3 讨论

昆虫核型分析是对细胞前中期和中期染色体数目、大小、形态等特征的分析研究[17]。对于遗传疾病机制、物种亲缘关系与进化，远缘杂种的鉴定具有重要意义，同时也是建立细胞系时对不同物种来源细胞系鉴定的最佳方法[18-20]。

蚋类核型分析是蚋类遗传防治和蚋类分类鉴定的重要实验方法，本研究主要通过兴义维蚋蚋卵(胚胎)原代细胞培养，选取细胞增殖过程中处于有丝分裂旺盛时期的原代细胞制作染色体，进行核型分析。研究结果显示兴义维蚋前中期和中期染色体数目均为3对(2n=6)，中期染色体高度凝集长度在4 μm左右，Ⅰ号染色体具中央着丝粒，Ⅱ和Ⅲ号染色体均为亚中央着丝粒(图3)。与黄丽等[10]制备兴义维蚋唾腺多线染色体数目2n=6相一致。兴义维蚋多线染色体是唾腺细胞中多股染色单体平行排列形成一种缆状巨大染色体，长度在20 μm左右[8]。

本研究主要是展示了蚋类原代细胞有丝分裂过程中前中期和中期染色体核型特征，一方面可协助分子分类鉴定培养细胞的种属来源；另一方面，完善了蚋类原代细胞培养的历史档案，便于与后期建成的细胞系的核型特征进行比较分析。不同蚋种来源细胞中期染色体在数量上较恒定(2n=6)。但对于不同蚋种细胞中期染色体大小、形态及带型上的差异及规律还有待进一步探索研究。

[1] 陈汉彬,张春林,杨明,等. 中国蚋科昆虫[M]. 贵阳:贵州科技出版社, 2016:104-109.

[2] 张礼生,张青文,蔡青年,等. 中国昆虫染色体研究现状与展望[J]. 昆虫学报, 2003(6):773-782.

[3] Peter HA,ümit DS. A new species of black fly in the Prosimulium hirtipes (Fries) group(Diptera: Simuliidae) from western turkey[J]. Proc Entl Socie Washi, 2015(2):85-94.

[4] Antonios AA,Elena D,Aggeliki GP,et al. Cytogenetic and symbiont analysis of five members of the B. dorsalis complex (Diptera, Tephritidae): no evidence of chromosomal or symbiont-based speciation events[J]. ZooKeys, 2015(540):273-298.

注:A为两个有丝分裂子代细胞，B为多个有丝分裂子代细胞

前中期染色体 前中期染色体核型

中期染色体 中期染色体核型

[5] Chubareva LA,Kachvorian EA. Morphological and karyotypic analysis of five blackflyspecies of the genus Cnetha (Diptera: Simulidae): description of the novel species from the canyon in Armenia[J]. Parazitologiia, 2000(6):470-476.

[6] Chubareva LA. A karyotypic analysis of 2 species of blackflies in the genus Prosimulium (Diptera: Simuliidae) from the Kola Peninsula and Kamchatka [J]. Parazitologiia, 2000(4):288-294.

[7] 温小军,韦静,陈汉彬. 河南纺蚋多线染色体研究[J]. 四川动物, 2007(3):525-527.

[8] 张建庆,张春林,陈汉彬,等. 黑水山蚋的唾腺多线染色体研究[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2008(2):96-102.

[9] Huang L,Zhang CL,Jiang YH,et al. Polytene chromosomes ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense(Diptera: Simuliidae) from China[J]. Acta Entomol Sin, 2012(8):988-993.

[10]黄丽,张春林,黄若洋,等. 黔蚋唾腺多线染色体研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2012(5):354-356.

[11] 温小军,韦静,陈汉彬. 五条蚋两地理株多线染色体比较研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2007(3):253-255.

[12] 周静,陈汉彬,杨明. 几种消毒剂对蚋卵原代细胞培养效果的比较[J]. 贵阳医学院学报, 2010(4):334-340.

[13] 翟中和,王喜忠,丁明孝. 细胞生物学[M]. 3版. 北京:高等教育出版社, 2007:343-354.

[14] Altlnordu F,Peruzzi L,Yu Y, et al. A tool for the analysis of chromosomes: KaryoType[J].Taxon, 2016(3):586-592.

[15] Prosanta S,Debabrata S,Avijit K,et al. Karyotype analysis and chromosomal evolution in Asian species of Corchorus (Malvaceae s.l.) [J]. Gene Reso Crop Evo, 2014(6):1173-1188.

[16] 余蕾,杨国珍,王碧,等. 贵阳地区染色体疾病儿童的染色体核型分析[J]. 贵州医科大学学报, 2015(11):1170-1175.

[17] Robert B, Angus, Teresa C,et al. A chromosomal analysis of eleven species of Gyrinidae (Coleoptera)[J]. Comp Cytogen, 2016(1):189-202.

[18] Al-Qahtani AH, Al-Khalifa MS, Al-Saleh AA. Karyotype, Meiosis and sperm fomation in the red palm Weevil Rhynchophorus ferrugineus[J]. Cytologia, 2014(2):235-242.

[19] Wagner FM,Pablo AM,Luiz AC.et al. Evidence for meiotic drive as an explanation for karyotype changes in fishes[J]. Mar Genomics, 2014(15):29-34.

[20] Beatriz V,Doris B. Numerous transitions of sex chromosomes in diptera[J].PLOS Biol, 2015(4):1-22.

(2016-07-30收稿，2016-11-11修回)

中文编辑： 周 凌； 英文编辑： 刘 华

Karyotype Analysis of Primary Cells Cultured from Blackfly Eggs(Embryos) ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

ZHOU Jing1, LIU Zhanyu2, XU Xu3, CUI Liqiu4, CHEN Hanbin4, YANG Ming4

(1.CollegeofBiologyandEngineering,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalCollege,Gannan341000,Jiangxi,China; 3.LiverDiseaseLaboratory,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.CollegeofBasicMedicalSciences,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To culture primary cells of blackfly eggs (embryos) and analyze their karyotype. Methods: The tissue block method was applied to treat the blackfly eggs (embryos) fromSimulium(Wilhelmia)xingyiensethat were collected in field. The blackfly eggs (embryos) were cultured in the modified Schneider's and Sang M3 medium at pH 6.0～6.5, and incubated in a biochemical incubator at 28 ℃. The primary cells in the mitotic and proliferative phase were selected and treated with colchicine, and their metaphase chromosomes were prepared for karyotype analysis. Results: The prometaphase chromosomes are 3 pairs(2n=6), which were not aggregated at a maximum degree and showed themselves long rhabditiform, and the length of chromosome is 9.43～13.58 μm. Metaphase chromosome was 3 pairs (2n=6), and which were highly aggregated and showed themselves short rhabditiform, and the length of chromosome was 2.43～4.67 μm. Two metaphase chromosomes' arm ratio is less than 1.67, belonging tocentric chromosome, and the 4 chromosomes' arm ratio is more than 1.67, belonging to the submetacentric chromosome. Conclusions: The karyotype characteristics of primary cells cultured from the blackfly eggs (embryos) ofSimulium(Wi.)xingyiensewere preliminarily elucidated in this study.

Simuliidae；Simulium(Wilhelmia)xingyiense; embryos; primary cells; karyotype analysis

国家自然科学基金(30660021)； 贵州省社会发展科技攻关计划[黔科郝晓宇合(2012)3100]； 贵州省科技计划项目[黔科合LH字(2016)7357]； 贵州医科大学高等学校2015年大学生创新创业训练计划项目(201510660034)

�� E-mail:culex@gmc.edu.cn

时间：2016-11-15 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.021.html

Q962； R384.5

A

1000-2707(2016)11-1241-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.001