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利用DNA条形码技术发现贵州省蚋类新记录*

2016-12-21张圣芳杨曜铭陈汉彬

贵州医科大学学报 2016年11期
关键词:德江关岭麻子

张圣芳, 贾 若, 杨曜铭, 王 毅, 寻 慧, 陈汉彬, 杨 明**

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室, 贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 基础医学院, 贵州 贵阳 550004)



利用DNA条形码技术发现贵州省蚋类新记录*

张圣芳1, 贾 若2, 杨曜铭2, 王 毅2, 寻 慧2, 陈汉彬2, 杨 明2**

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室, 贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 基础医学院, 贵州 贵阳 550004)

目的: 综合利用DNA条形码序列和形态学特征鉴定蚋种。方法:利用车载式捕虫网于2014年7~9月在贵州省雷山、江口、德江、关岭和开阳5县采集蚋类标本,并进行初步的形态学鉴定;测定雌蚋DNA条形码序列,利用生命数据条形码系统(BOLD)及系统发育分析方法鉴定蚋种。结果:初步确定划分蚋属下蚋种的K2P距离阈值为4%,利用该阈值及生命数据条形码系统鉴定153只雌蚋为麻子绳蚋。结论:麻子绳蚋为贵州省蚋类新记录,分布于雷山、江口、德江、关岭和开阳5县。

蚋科; DNA条形码; 生物形态; 贵州; 生命数据条形码系统; 系统发育分析

蚋类,又称黑蝇(Black fly),属于双翅目(Diptera)、蚋科(Simuliidae),是医学昆虫中一类重要的媒介昆虫。蚋类通过刺叮吸血,骚扰人畜禽或传播疾病,在生活和生产上给人类带来不同程度的危害[1]。蚋类具有突出的形态相似性,种属鉴定通常需要不同发育时期(包括幼虫、蛹和成虫)的成套标本,对单一虫期标本的鉴定往往十分困难[2]。近年来,本研究借鉴国外方法,利用车载式捕虫网采集蚋类成虫,涉及对单个雌虫进行鉴定的问题[3]。单个雌虫无法用形态学方法予以准确鉴定,需利用DNA条形码技术(DNA barcoding)进行辅助鉴定。DNA条形码技术由Hebert等[4]于2003年提出,核心思想是以线粒体COⅠ基因5′端一长658 bp的序列(称为DNA条形码)作为鉴定动物物种的通用遗传标记,该技术在双翅目、直翅目、膜翅目、蜻蜓目[9]等昆虫的物种鉴定上得到了很好的应用,该技术也应用于蚋类种属鉴定[5-10]。Conflitti等[11]结合DNA条形码与地理及生态信息鉴定克蚋属(Cnephia)5蚋种,Day和Bernotien等[12-13]以DNA条形码来厘清爬蚋复组(S.reptanscomplex)的近缘种分类问题。本研究室2008年开始蚋类COⅠ基因序列研究,逐渐建立了可用于贵州省蚋类鉴定DNA条形码大纲(profile)[14]。贵州省蚋类分类学研究比较成熟,现已发现1属35种[2]。本文用DNA条形码技术对车载式捕虫网采集到的蚋类进行研究,结合系统发育分析方法,发现尚未报道分布于贵州省的蚋种麻子绳蚋(S.asakoae),报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与软件

体视显微镜(日本)、电热恒温水浴锅(中国)、UVP凝胶成像系统(美国)、梯度PCR扩增仪(德国)、蛋白核酸分析仪(美国)、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物技术有限公司)、2X Taq PCR Master Mix(含染料)(上海生工生物技术有限公司)、Trans 2k DNA Marker(上海生工生物技术有限公司)、Trans DNA Marker I(上海生工生物技术有限公司)。主要应用软件为Chromas 2.41、DNAMAN V6、MEGA 6.06和PHYLIP 3.695。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 参照Davies和Roberts[3]的方法,设计制作车载式捕虫设备,采集蚋类成虫。于2014年7~9月在贵州雷山、江口、德江、关岭和开阳进行采集。依据蚋喜于晨曦和薄暮寻求血源、侵袭人畜最为频繁的特点,选择采集时间在日出和日落前后1 h。

1.2.2 形态学鉴定 在体视镜下解剖雌蚋,尾器制片作为凭证标本,蚋其余部位保存于95%酒精中,用于提取基因组DNA。按常规方法进行形态学鉴定[1]。

1.2.3 基因组DNA提取 使用上海生工生物公司Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取单个蚋基因组DNA,-20 ℃贮存备用。

1.2.4 PCR引物选择 沿用本课题组自行设计的蚋类COⅠ基因通用引物cu1cd2和Hebert等[4]的引物序列Lco14490Hco2198。cu1的引物序列为5′-ACC ACT TTT ATC AGC CAT TT-3′,cd2的引物序列 5′-CAC TAA TCT GCC ATA TTA GA-3′,产物约1 600 bp。Lco14490的引物序列为 5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′,Hco2198引物序列为5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′,产物约710 bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2.5 PCR扩增反应体系 PCR扩增应体系的总体积为25 μL,包括12.5 μL PCR MasterMix,10.7 μL蒸馏水,0.4 μL的上游引物和0.4 μL的下游引物,1 μL模板。反应条件为:94 ℃预变性5 min后进入30个循环,94 ℃变性45 s,52 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,最后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。

1.2.6 PCR产物检测与测序 吸取5 μL PCR产物,1%琼脂糖凝胶电泳,恒压180 V电泳20 min,在UVP凝胶成像系统下观察并记录结果。PCR产物测序由英潍捷基公司进行,双向测序。

1.2.7 蚋类COⅠ基因序列处理 用DNAMAN V6序列拼接程序剪切出用于分析的658 bp DNA条形码序列。

1.2.8 蚋种鉴定 在BOLDSYSTEMS的动物COⅠ鉴定页面(http://boldsystems.org/ index.php/ IDS_OpenIdEngine)中输入待鉴定的蚋类COⅠ基因658 bp序列,提交鉴定,并记录结果[15]。

1.2.9 K2P距离(Kimura-2-parameter distance)分析 利用PHYLIP3.695软件中的dnadist程序进行。

1.2.10 序列比对与系统发育分析 用 MEGA6.06软件包的Alignment Explorer工具进行序列比对[16-17]。以邻接法(neighbor-joining,NJ)进行系统发育分析,选择K2P模型,Bootstrap值设为1 000。

2 结果

根据形态学特征,对153个属同一蚋种(但不是贵州省已知蚋种)的雌蚋个体(表1)进行COⅠ基因序列分析。测定153个个体的DNA条形码序列,共得28种不同序列,其他125个个体的序列分别与这28种序列相同。28种序列的K2P距离最大为3.7%。用BOLDSYSTEMS对28种序列进行鉴定,17种被鉴定为麻子绳蚋Simulium(Gomphostilbia)asakoae,11种未得到鉴定。检索GenBank和BOLDSYSTEMS中包含完整658bp条形码且已知蚋种的蚋属(Simulium)序列,分别获得464条和

表1 153个雌蚋的分布

Tab.1 Distribution of 153 female blackflies

采集地采集地经纬度数目雷山26°23'36.24″N,108°4'28.92″E17江口27°41'22.13″N,108°50'44.79″E76德江28°15'19.29″N,108°06'52.25″E7关岭25°55'59.46″N,105°36'25.42″E23开阳27°03'14.13″N,106°58'30.83″E30

486条序列,与本课题组之前测定的103条已知蚋种序列(未发表)一起,成为包含1 053条序列的蚋类DNA条形码大纲。该大纲含149个蚋种,平均K2P距离为14.7%。在149个蚋种组成的11 026个物种对中,仅有104对的K2P距离小于4%,占全部物种对的0.9%。因此,选择4%的K2P距离为划分蚋属下蚋种的阈值。以上述28种序列与蚋类DNA条形码大纲的1 053条序列一起,进行系统发育分析,发现28种序列与已知麻子绳蚋序列(共3条,GenBank编号为KM410170、KM410171和KM410172)构成单独的分支(branch)。28种序列与已知麻子绳蚋序列(3条)的K2P距离为1.1%~3.4%,在种内差异范围内。28种序列与已知非麻子绳蚋序列(1 050条)的K2P距离为5.7%~21.1%,达到种间差异水平。进一步检视28种序列相应的尾器凭证标本(图1),发现符合麻子绳蚋形态特征,即生殖板三角形、内缘骨化和侧缘中凹,生殖叉突前臂骨化、后臂无外突及两端骨化,从而确认28种序列代表的蚋种为麻子绳蚋。麻子绳蚋为贵州省蚋类新记录,分布于雷山、江口、德江、关岭和开阳5县。

图1 麻子绳蚋雌性尾器(40×)

3 讨论

现已知蚋类2 204种,其中,蚋属1 745种[18]。我们根据蚋属149种的已知DNA条形码,初步确定以4%的K2P距离为划分蚋属下蚋种的阈值。由于149个蚋种构成的物种对中,K2P距离小于4%的占0.9%,意味着以4%为蚋种划分标准,准确性可以达到99%以上。Hebert等[4]在研究鳞翅目昆虫时,以3%(K2P)为判断物种的阈值,准确性可达到98%。Hebert等[4]认为,同一属下的物种,可能因为成种时间晚近,而使得COⅠ基因序列的趋异较小。对于K2P距离较小(<4%)的蚋类物种对,可能还存在其他解释。例如,在我们分析的149个蚋种中,节蚋(S.nodosum)和素木蚋(S.shirakii)的DNA条形码序列完全一致,即K2P距离为0,说明节蚋和素木蚋很可能就是同一蚋种。关于节蚋和素木蚋是否为同一蚋种,在分类学上尚存在争议,这与本课题组的研究结果相符。

已报道麻子绳蚋分布于马来西亚、泰国、越南及中国香港[2,18],因此本文综合形态特征、BOLDSYSTEMS鉴定和系统发育分析所鉴定的麻子绳蚋,为贵州省新记录种。贵州省已知的蚋属35蚋种,均为在幼期孽生地(河流、溪流)采集标本,对幼期标本(幼虫或蛹)及从蛹羽化而得的成虫进行鉴定而定种[2]。本文报道的贵州省新记录麻子绳蚋,系以车载式捕虫网采获,且发现该蚋种在贵州省分布较为广泛,分布于雷山、江口、德江、关岭和开阳5县。但以传统方法采集标本时,并未发现该蚋种,说明车载式方法对于蚋类研究是一个很好的补充。

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(2016-08-01收稿,2016-11-03修回)

中文编辑: 刘 平; 英文编辑: 刘 华

A New Record of Simuliidae Found by DNA Barcoding in Guizhou Province

ZHANG Shengfang1, JIA Ruo2, YANG Yaoming2, Wang Yi2, XUN Hui2, CHEN Hanbin2, YANG Ming2

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.BasicMedicalCollege,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guihzou,China)

Objective: To identify blackfly species with combined data of DNA barcodes and morphological characteristics. Methods: Blackflies were collected with a vehicle-mounted trap on July to September of 2014 at Leishan, Jiangkou, Dejiang, Guanling, and Kaiyang counties in Guizhou Province, and preliminary morphological identification was performed. Female simulium DNA barcode sequence was detected. Barcode of Life Data Systems (BOLD) and phylogenetic analysis methods were adopted to identify blackfly species. Results: It was preliminarily determined that the threshold value of K2P distance in differentiating Simulium blackfly species and 153Simulium(Gomphostilbia)asakoaeindividuals were identified with BOLD and the threshold value. Conclusion: S. (G.) asakoae is a new record of blackfly, distributing at Leishan, Jiangkou, Dejiang, Guanling, and Kaiyang in Guizhou Province.

simuliidae; DNA barcode; organism forms; Guizhou; barcode of life data systems; phylogenetic analysis

贵州省社会发展攻关项目[黔科合SY(2012)3083]; 国家自然科学基金(30660021)

�� E-mail:id.yang.ming@gmail.com

时间:2016-11-15 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.028.html

R384.5; Q962

A

1000-2707(2016)11-1245-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.002

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