IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白对溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗作用及其机制研究

陈尧，蒋小华，郑萍，陶庆松

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.同济大学附属东方医院 胃肠外科，上海 200120；3.东南大学附属中大医院 普通外科，江苏 南京 210009； 4.同济大学附属东方医院 消化内科，上海 200120)



·论 著·

IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白对溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗作用及其机制研究

陈尧1，蒋小华2，3，郑萍4，陶庆松3

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.同济大学附属东方医院 胃肠外科，上海 200120；3.东南大学附属中大医院 普通外科，江苏 南京 210009； 4.同济大学附属东方医院 消化内科，上海 200120)

目的:探讨IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白(IL- 15 mutant/Fc)对溃疡性结肠炎(UC)小鼠模型的治疗作用及其可能的作用机制。 方法:5%葡聚糖硫酸钠(DSS)连续饮用制成UC模型，随机将30只小鼠分为对照组、IL- 15 mutant/Fc治疗组、IgG2a治疗组，观察小鼠一般体重情况。造模完成后取结肠行大体病理观察，并行伊红染色，查看其病理学损伤水平。ELISA分析小鼠眼球血的IL- 10、IL- 15、TNF- α炎症因子的含量，RT- PCR测定结肠组织STAT3和STAT5 mRNA的表达，蛋白质印迹法测定磷酸化STAT5(p- STAT5)以及磷酸化AKT(p- AKT)蛋白的表达。结果:除对照组小鼠外，其他两组均出现一般情况及体重改变。而IL- 15 mutant/Fc组小鼠的症状以及组织病理学评分均轻于IgG2a组。IL- 15 mutant/Fc可改善IL- 10、IL- 15、TNF- α的分泌情况。IL- 15 mutant/Fc抑制STAT5 mRNA、STAT3 mRNA表达以及p- STAT5、p- AKT蛋白的表达。结论：IL- 15 mutant/Fc在体内具有改善模型UC小鼠病情的作用，它可能通过特异性的拮抗IL- 15受体来干预STAT、AKT信号通路的信号转导而发挥其治疗作用。

融合蛋白； 模型溃疡性结肠炎； 白细胞介素15； 小鼠

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)又称非特异性溃疡性结肠炎，是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的一种类型。病变多数累及直肠和乙状结肠。近几年来，UC的发病率逐渐上升。目前UC的治疗以药物控制为主，氨基水杨酸及类固醇激素等传统药物对UC的治愈效果有限，外科手术也只限于病情严重者和并发症的处理[1- 2],因此寻找更有效的药物在UC治疗研究中具有十分关键的作用。白介素15(interleukin- 15，IL- 15)1994年由Grabstein等[3]发现，其对众多免疫细胞的发生发展、增殖分化都起到重要的调控作用，近年来，关于IL- 15与IBD发病的研究逐渐增多，已经证明IL- 15及其受体在IBD时表达明显高于正常[4- 5]。IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白(IL- 15 mutant/Fc)是将点突变的IL- 15基因与鼠IgG2a恒定区融合构建的。IL- 15 mutant/Fc与IL- 15受体以极高的亲和力特异性结合，从而起到IL- 15受体特异性拮抗剂的作用。研究表明IL- 15 mutant/Fc可以有效逆转葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS)小鼠模型中促炎和抑炎因子的比例[6]，并改善肠黏膜固有层组织病理学表现。本实验通过构建UC小鼠模型，评价IL- 15 mutant/Fc对实验性UC的治疗效果，并进一步研究其对UC模型的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器

6～8周龄Balb/c雌性小鼠，体重16～21 g，购自南京沐涂医疗科技有限公司，DSS购自上海前尘生物公司，IL- 15 mutant/Fc融合蛋白由东方医院转化医学平台构建。ELISA试剂盒购自eBioscience公司，Multiskan MK3酶标仪购自美国Thermo公司。ECL发光液购自美国Thermo公司。Trizol试剂购自TaKaRa公司。多聚酶链反应引物由南京墨迹公司合成。磷酸化STAT5(p- STAT5)抗体以及磷酸化AKT(p- AKT)抗体均产自R&D公司，定量PCR仪为ABI Stepone plus 荧光定量PCR系统。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 随机将30只小鼠分为对照组、IL- 15 mutant/Fc治疗组和IgG2a治疗组各10只，对照组以正常饮用水连续饮用10 d，IL- 15 mutant/Fc治疗组和IgG2a治疗组按文献[7]描述的以5%的DSS饮用水连续饮用7 d制备实验性UC模型，造模3 d后IL- 15 mutant/Fc治疗组和IgG2a治疗组每只小鼠分别予IL- 15 mutant/Fc 5μg·(100μl·d)-1和IgG2a 5μg·(100μl·d)-1连续腹腔注射7 d。

1.2.2 小鼠结肠炎症评价 察看并记录小鼠每天的状态及活动情况，观察其粪便颜色及性状等，记录体重。于造模开始的第10天取完眼球血后全部处死并取距肛门1～5 cm处结肠,将取下组织行伊红染色评估炎症情况。根据Neurath等[8]的评分标准行组织病理评分，积分越高表明黏膜炎症的严重程度越重。

1.2.3 ELISA检测 眼球血中炎症细胞因子IL- 10、IL- 15和TNF- α浓度的测定用ELISA法[9]。眼球血样品室温放置2 h后离心。取上清检测，并以2倍法稀释。同时分成空白孔、标准孔以及待测样品孔。先在3组孔中注入稀释液50μl。空白孔和另外两孔中分别加入标准品和待检测的样品各50μl。所有组孔中加入生物素化的抗体50μl。37 ℃温度下孵育2 h后将所有孔内液体甩干,并洗板3次，每孔加酶结合物100μl，盖覆膜37 ℃温浴1 h。将所有孔内液体甩干，洗板5次后加底物显色液(TMB)100μl。37 ℃避光孵育30 min左右后所有孔中均加入终止试剂100μl。立即测量各孔的光密度。

1.2.4 RT- PCR检测结肠组织STAT3及STAT5 mRNA的表达 Trizol法提取细胞总RNA，并用紫外分光光度计检测其浓度。按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA后取2μl cDNA加入PCR体系中进行扩增，扩增条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，40个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min。PCR引物序列见表1。扩增完成后将各样品两个不同的基因进行实时荧光定量PCR，再对各样品所测得的基因量进行分析后得出基因相对含量。

表1 目的基因引物序列及大小

基 因引物序列片段大小/bpSTAT3F⁃GCCACGTTGGTGTTTCATAATC97R⁃TTCGAAGGTTGTGCTGATAGAGSTAT5F⁃CCGAAACCTCTGGAATCTGAA100R⁃GGTCTGGGAACACGTAGATAAGGAPDHF⁃GGTGTGAACCACGAGAAATATGAC127R⁃TCATGAGCCCTTCCACAATG

1.2.5 蛋白质印迹法检测结肠组织p- STAT5和p- AKT蛋白的表达 提取蛋白完成后并测定其含量后进行电泳。电泳结束后进行转膜，准备4张比膜稍小或一样大的滤纸和1张PVDF膜，并将该膜置于甲醇溶液中活化1 min。在转膜仪上，首先将已经泡好的两层滤纸叠放在转膜仪平台上，并赶走中间的气泡，然后将PVDF膜放于滤纸上。在PVDF膜上放置好分离胶以及2层滤纸后在0.32 mA的电流下转膜2 h。将膜取出放置于一有封闭液的平皿中，室温封闭4 h。弃封闭液，加入1∶1 000稀释的多抗，4 ℃培养过夜。室温下以TBST脱色摇床反复清洗3次。加入二抗，室温下培养2 h后继续清洗次数同上。加入增强化学发光(ECL)显色液，于Tanon凝胶成像仪下拍照，获取图片。以β- 肌动蛋白作为内参。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 一般情况及体重变化

IL- 15 mutant/Fc治疗组和IgG2a治疗组的小鼠在UC诱导当天即出现精神不振、活动减少等表现。第3天大便多为黏液型稀便，上述表现于第5天达到顶峰。IL- 15 mutant/Fc治疗组部分小鼠第8天开始好转，第1、5号小鼠分别于造模第8、9天死亡。IgG2a治疗组症状未见明显好转，第1、2、6号小鼠于第8天死亡，实验第10天后各组小鼠每天体重变化见图1，统计分析显示IL- 15 mutant/Fc治疗组体重降低幅度小于IgG2a治疗组(P<0.05)。

图1 各组小鼠每天体重变化

2.2 结肠组织病理评分

对照组小鼠结肠组织未见病理学改变；IgG2a治疗组小鼠结肠标本切片在光镜下可见肠道增厚，黏膜及黏膜下层出现充血水肿，上皮细胞坏死脱落，黏膜层、黏膜下层甚至肌层内有大量炎症细胞的浸润，淋巴组织大量增生。隐窝损伤甚至消失；IL- 15 mutant/Fc治疗组亦表现出黏膜充血、水肿,上皮细胞坏死脱落等改变，但病变程度明显轻于IgG2a治疗组，愈合较好(图2)。3组的组织病理评分显示：IL- 15 mutant/Fc治疗组结肠炎病变评分为3.10±2.31，与对照组(0.00±0.00)比较结肠病变严重程度增加(P<0.05)；IgG2a治疗组结肠炎病变评分为10.17±4.58，病变程度显著重于对照组(P<0.01)；IL- 15 mutant/Fc治疗组病变程度显著低于IgG2a治疗组(P<0.05)。

2.3 眼球血的IL- 10、IL- 15、TNF- α炎症因子的表达

眼球血样品于室温放置2 h，取上清液经ELISA分析发现，细胞因子IL- 10、IL- 15、TNF- α均有表达。IL- 15 mutant/Fc融合蛋白组和IgG2a治疗组IL- 15和TNF- α的表达均高于对照组(均P<0.05)，两组IL- 10的表达均低于对照组(均P<0.05)；IL- 15 mutant/Fc融合蛋白治疗组IL- 15和TNF- α的表达均低于IgG2a治疗组(均P<0.05)，IL- 10的表达高于IgG2a治疗组(P<0.05)。见表2。

图2 各组小鼠结肠组织HE染色 ×200

表2 3组细胞因子的表达 pg·ml-1

a 与对照组比较，P<0.05； b 与IgG2a治疗组比较，P<0.05

2.4 STAT3 mRNA、STAT5 mRNA、p- STAT5及p- AKT蛋白的表达

STAT3 mRNA表达水平IL- 15 mutant/Fc治疗组低于IgG2a治疗组(P<0.05)而略高于对照组(P>0.05)，IgG2a治疗组高于对照组(P<0.05)(图3A)。STAT5 mRNA表达水平IL- 15 mutant/Fc治疗组低于IgG2a治疗组(P<0.05)，IL- 15 mutant/Fc治疗组及IgG2a治疗组均高于对照组(均P<0.05)(图3B)。p- AKT和p- STAT5蛋白表达水平IL- 15 mutant/Fc治疗组低于IgG2a治疗组及对照组(均P<0.05)(图4A、B)。

A.STAT3 mRNA 相对表达量； B.STAT5 mRNA 相对表达量

图3 各组小鼠结肠组织STAT3、STAT5 mRNA 相对表达量

A.p- AKT、AKT及β- 肌动蛋白的表达； B.p- STAT5、STAT5及β- 肌动蛋白的表达； 1.对照组； 2.IgG2a治疗组； 3.IL- 15 mutant/Fc治疗组

图4 各组小鼠结肠标本p- AKT、AKT、p- STAT5、STAT5及β- 肌动蛋白的表达

3 讨 论

对小鼠一般精神状态、活动情况、体重、结肠组织的病理分析比较表明，IL- 15 mutant/Fc对UC有较好的治疗作用，对其肠道改变也有一定的改善作用。IL- 15是一种炎症促进因子和T细胞生长因子，主要由上皮细胞、内皮细胞等多种细胞产生，对许多细胞如单核/巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞的发生发展、增殖分化都起到重要的调控作用[6]。IL- 15与IL- 2具有相似生物学活性，它们都是T淋巴细胞生长的激活者、细胞毒效应细胞的诱导者，是T细胞的化学引诱物、NK细胞活化的刺激者，并且是IFN- γ和TNF- α产生的促进者[10]。所以IL- 15被认为不仅与固有性免疫有关，同时还兼顾着适应性免疫的发生发展[11- 12]。IL- 15 mutant/Fc是将点突变的IL- 15基因与鼠IgG2a恒定区融合，成功构建的IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白。Fc融合蛋白具有诸多明显优势[13- 14]，完整地保留了目标分子的全部生物活性，完全是自体的基因产物，抗原性极低，免疫球蛋白半衰期长，血浆浓度高，且具有潜在的引发免疫杀伤功能的特性，针对目标靶点的特异性强，亲和力高。本实验IL- 15 mutant/Fc治疗组相较于IgG2a治疗组促炎症细胞因子IL- 15及TNF- α的分泌下降，而相关的炎症抑制因子IL- 10的分泌上升。上述结果可以证明IL- 15 mutant/Fc或许对UC时炎症细胞因子分化失衡起到了十分重要的干预作用。IL- 15 mutant/Fc治疗组中IL- 15信号通路上的p- STAT5、p- AKT分子蛋白水平及STAT3、STAT5 mRNA的水平相较于IgG2a组显著下降，IL- 15可与其受体相结合，激活STAT的信号通路，从而促进T细胞以及炎症因子产物的增殖以及活化[15- 16]。而激活AKT这一通路后可以调整细胞发育生长中的增殖、分化和迁移[17- 18]。这些可能是UC发病的重要原因。本研究中，IL- 15 mutant/Fc治疗组的STAT5 mRNA、STAT3 mRNA表达水平均低于IgG2a治疗组，而p- STAT5及p- AKT蛋白表达水平低于IgG2a治疗组。IL- 15 mutant/Fc抑制了STAT5、STAT3 mRNA及p- STAT5、p- AKT蛋白的表达，从而可能抑制了T细胞和炎症因子产物的增殖及活化，减轻了黏膜的充血水肿情况，同时也就减轻了炎症反应。

本实验结果表明，IL- 15 mutant/Fc对UC小鼠有较好治疗作用，其机制可能是参与下调IL- 15信号通路中发挥重要作用的信号分子STAT3、STAT5核酸或p- STAT5、p- AKT蛋白的表达，干预IL- 15下游重要通路的信号传导，从而发挥治疗作用。鉴于融合蛋白相较传统单克隆抗体类生物制剂的明显优势,以及我们本实验中显示出的对UC动物模型炎症因子表达谱紊乱及肠道炎症的有效干预作用，这势必进一步为融合蛋白应用于UC临床靶向治疗提供有力的理论和实验支持。

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Therapeutic effect and mechanisms of IL- 15 mutant/Fcγ2a fusion protein in mice with ulcerative colitis

CHEN Yao1， JIANG Xiao- hua2，3，ZHENG Ping4，TAO Qing- song3

(1.School of Medicine，Southeast University，Nanjing 210009，China； 2.Department of Gastrointestinal Surgery，EastHospital，TongjiUniversity，Shanghai200120，China； 3.DepartmentofGeneralSurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 4.DepartmentofGastroenterology，EastHospital，TongjiUniversity，Shanghai200120，China)

Objective： To investigate the therapeutic effect and mechanisms of IL- 15 mutant/Fcγ2a fusion protein(IL- 15 mutant/Fc)in mice with ulcerative colitis(UC). Methods: Thirty mice were randomly divided into control group， IL- 15 mutant/Fc treatment group and IgG2a treatment group.UC model was induced in the latter two groups by giving 5% dextran sulphate sodium in drinking water for 7 consecutive days. In the experiment， the general condition and weight of the mice were observed，and the protective effects were evaluated by macroscopic and pathologic examinations. Hematoxylin- eosin(HE)staining of the distal colon mucosa of mice in each group was performed to study the histopathological injury and histological scores. The concentration of inflammatory cytokines(IL- 10，IL- 15，TNF- α) in ocular blood of mice was determined by ELISA assay. Expression of STAT3 and STAT5 mRNA and expression of p- STAT5 and p- AKT protein were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT- PCR) and Western Blot respectively. Results: Compared with the control group， mice in other two groups showed poor general conditions and changes in body weight，but the general conditions and histopathological score of mice in IL- 15 mutant/Fc treatment group were better than those in IgG2a treatment group. The secretion disorder of pro- inflammatory cytokines and anti- inflammatory cytokine could be partially alleviated by injection of IL- 15mutant/Fc demonstrated by increasing IL- 10 and decreasing IL- 15 and TNF- α. The levels of STAT3 and STAT5 mRNA， and of p- STAT5 and p- AKT protein in IL- 15 mutant/Fc treatment group were obviously lower than those in IgG2a treatment group(P<0.05). Conclusion: As a specific IL- 15 receptor antagonist， IL- 15 mutant/Fc can achieve its therapeutic effect on UC by intervening the signaling pathway through regulating the mRNA or protein expressions of key signal molecules， such as STAT and AKT．

fusion protein; ulcerative colitis model; interleukin- 15； mice

2016- 01- 20

2016- 03- 04

陈尧(1990-)，男，江苏苏州人，在读硕士研究生。E- mail：cyssforever@126.com

蒋小华 E- mail：jxh@medmail.com.cn

陈尧，蒋小华，郑萍，等.IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白对溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗作用及其机制研究[J].东南大学学报：医学版，2016，35(4)：559- 564．

R574.62； R- 33

A

1671- 6264(2016)04- 0559- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.020