二型固有淋巴细胞相关因子在食管癌患者外周血中的表达情况分析

纪勇，胡斌，朱乾坤，朱幸枫，徐震壮，吴小波

(南京医科大学 附属无锡市人民医院，江苏 无锡 214023)



·论 著·

二型固有淋巴细胞相关因子在食管癌患者外周血中的表达情况分析

纪勇，胡斌，朱乾坤，朱幸枫，徐震壮，吴小波

(南京医科大学 附属无锡市人民医院，江苏 无锡 214023)

目的：探讨二型固有淋巴细胞(ILC2s)在食管癌发生发展中的作用。方法：荧光定量PCR技术检测我院手术治疗的食管癌患者及健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)中GATA3、RORα、T1/ST2及IL- 33 mRNA的表达量；ELISA技术检测血浆中IL- 33含量。结果：食管癌患者PBMC中ILC2s相关分子转录因子GATA3和RORα、表面膜受体T1/ST2及活化分子IL- 33的mRNA水平都比健康人高，并且患者血浆IL- 33含量明显升高(P<0.05)。结论：食管癌患者ILC2s效应增强，可能通过效应分子的分泌及介导Th2细胞的极化而在食管癌的发生发展中发挥重要作用。

二型固有淋巴细胞； Th2细胞； 食管癌

食管癌是目前全球发病率较高的恶性肿瘤，并且预后差、死亡率高。高复发率和易转移是食管癌预后不良的主要原因之一。随着肿瘤免疫学研究的深入，人们发现肿瘤患者体内存在多种免疫抑制性细胞，这些细胞及其分泌的相关因子抑制机体的抗肿瘤免疫应答，构成一个免疫抑制性的环境，利于肿瘤细胞逃避机体免疫应答，是阻碍肿瘤治疗成功的一大障碍。食管癌患者Th1与Th2比例失衡是肿瘤逃避机体抗肿瘤免疫应答的主要原因之一[1]。二型固有淋巴细胞(group 2 innate lymphoid cells， ILC2s)在Th2细胞介导的免疫应答中扮演重要作用[2]。本研究通过检测ILC2s特异性转录因子、相关细胞因子及膜表面细胞因子受体，分析ILC2s在食管癌患者外周血中的情况，探讨ILC2s在食管癌发生发展中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集我院2012年11月至2014年2月新确诊的食管癌患者42例，其中男30例，女12例，年龄34～68岁，平均57.4岁。所有患者的临床和实验室检查均符合食管癌的诊断标准，并且外周血液标本收集时患者均未经临床处理。30名健康体检者标本作为对照，其中男20例，女10例，年龄35～74岁，平均58.4岁，既往有过敏病史或合并慢性支气管炎、高血压、糖尿病患者予以排除。两组研究对象性别、年龄、病情等方面差异无统计学意义(P>0.05)。研究方案经我院伦理委员会批准，所有受检者都签订知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集 收集外周血标本后分离出血浆并置于-80 ℃保存，Ficoll分离液(上海博升生物科技有限公司)分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并加入1 ml Trizol(Invitrogen公司)，-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2.2 RNA提取及定量PCR 用异硫氰酸胍/苯酚法人总RNA提取试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)提取PBMC总RNA；取500 ng RNA，使用Prime Script RT Reagent Kit Perfect Real Time试剂盒 (TaKaRa公司)进行逆转录；以GenBank为基础，使用Premier 5.0软件设计引物(表1)，由上海Invitrogen公司合成；使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)进行荧光定量PCR。各目的基因相对β- 肌动蛋白表达的倍数变化用基于阈值循环数(Ct)的方式计算。所有样本分别独立检测3次。

表1 定量PCR各引物序列

Tab 1 Quantitative PCR sequences for each primers

基 因引 物GATA3上游：5′⁃TTGTGGTGGTCTGACAGTTC⁃3′下游：5′⁃AGTACAGCTCCGGACTCTTC⁃3′RORα上游：5′⁃CTGACGAGGACAGGAGTAGG⁃3′下游：5′⁃GTGCGCAGACAGAGCTATTC⁃3′T1/ST2上游：5′⁃AGATGAGTCACTGGCATACG⁃3′下游：5′⁃GAGAGGCTGGCTGTTGTATT⁃3′IL⁃33上游：5′⁃TGACGGTGTTGATGGTAAGATG⁃3′下游：5′⁃ACAGAGTGTTCCTTGTTGTTGG⁃3′β⁃肌动蛋白上游：5′⁃TGGCACCCAGCACAATGAA⁃3′下游：5′⁃CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA⁃3′

1.2.3 ELISA方法检测血浆细胞因子 血浆IL- 33水平用ELISA试剂盒(上海沪尚生物科技有限公司)检测，各样品均重复检测3次，求平均浓度，用标准曲线法计算血浆含量。

1.3 统计学处理

使用Graph Pad Prism 5.0软件进行统计学分析，组间比较采用非配对t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 食管癌患者PBMC中RORα和GATA3表达升高

RORα和GATA3是ILC2s形成和发挥功能的重要转录因子，定量PCR分析食管癌患者及健康对照者PBMC中RORα和GATA3的表达情况，结果显示，食管癌患者PBMC中RORα和GATA3表达水平较健康对照者明显升高(图1)。

a与对照比较，P<0.05

图1 PBMC中RORα mRNA和GATA3 mRNA表达水平的比较

Fig 1 The expression level of RORα mRNA and GATA3 mRNA in PBMC

2.2 食管癌患者PBMC中ILC2s表面分子T1/ST2 mRNA的表达升高

T1/ST2是ILC2s表面相对特异性的受体分子，比较食管癌患者和健康对照者T1/ST2的PBMC中T1/ST2 mRNA的表达情况，结果显示，食管癌患者T1/ST2 mRNA的表达明显升高(图2)。

2.3 食管癌患者PBMC中IL- 33 mRNA水平增高并且血浆中IL- 33含量增加

IL- 33能够诱导ILCs和Th2细胞的极化，通过定量PCR检测PBMC中IL- 33 mRNA水平，用ELISA方法检测血浆IL- 33含量，结果显示，食管癌患者PBMC中IL- 33 mRNA水平明显增高，血浆中IL- 33含量明显增多(图3)。

a 与对照比较，P<0.05

图2 TT1/ST2的变化

Fig 2 The expression level change of TT1/ST2

a 与对照比较，P<0.05； b 与对照比较,P<0.05

图3 IL- 33在PBMC和血浆中表达水平的比较

Fig 3 The level of IL- 33 mRNA in PBMC and the level of IL- 33 in plasma

3 讨 论

ILC2s是最近才被认识的一群细胞，又称为nuocytes、固有辅助细胞或者天然辅助细胞，可以被IL- 25和(或)IL- 33活化。ILC2s高表达T1/ST2、IL- 17BR、IL- 7Rα、ICOS和CD45。ILC2s分泌的IL- 13和IL- 5能诱导机体早期的Th2型免疫应答，在机体抗寄生虫感染及气道炎症反应方面具有重要作用[3- 4]。而且文献报道显示ILC2s能抑制过敏性哮喘相关的气道高反应性[5]。除此之外，ILC2s对急性流感病毒感染所致的气道组织损伤具有修复作用[6]。已经证实CD4+Th1细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是机体发挥抗肿瘤免疫力的主要细胞群，然而免疫反应偏离Th2型应答时，Th1细胞反应将受到抑制[7]。最近研究发现，该ILC2s是肺部精氨酸酶1(Arg1)的重要来源之一，并且IL- 33通过增加ILC2s和巨噬细胞的数量从而活化Arg1[8]。肿瘤发生时，Arg1通过多种效应抑制T细胞的作用，使肿瘤逃避机体的抗肿瘤免疫应答。

本研究中我们分析了食管癌患者PBMC中ILC2s相关因子的表达水平，结果显示，食管癌患者PBMC中转录因子RORα和GATA3、膜表面受体T1/ST2及二型细胞因子IL- 33的mRNA水平都增高，并且血浆中IL- 33水平也明显增高。这些说明食管癌发生时，ILC2s效应增强，并且可能通过介导机体偏向Th2免疫应答的方式促进肿瘤的免疫逃逸，从而利于食管癌发生发展。但ILC2s介导Th2型应答的详细机制还有待进一步研究。

总之，通过特异性转录因子、受体和相关的细胞因子的检测，我们发现，食管癌患者ILC2s增多，这可能参与Th1/Th2细胞的不平衡，从而抑制机体的抗肿瘤免疫应答，但ILC2s在食管癌中的作用仍有待进一步研究。

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Analysis of the expression of ILC2s associated moleculars in peripheral blood mononuclear cells of esophageal cancer patients

JI Yong，HU Bin，ZHU Qian- kun，ZHU Xin- feng，XU Zhen- zhuang，WU Xiao- bo

(Wuxi People，s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi 214023，China)

Objective: To investigate the role of group 2 innate lymphoid cells(ILC2s) in the genesis and development of esophageal cancer. Methods: Quantitative PCR was used to examine the expression of GATA3，RORα，T1/ST2 and IL- 33 mRNA of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)， and ELISA was used to detect the level of IL- 33 in the plasma of esophageal cancer patients and healthy controls. Results: The expression of GATA3，RORα，T1/ST2 and IL- 33 mRNA of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) and the level of IL- 33 in the plasma of esophageal cancer patients were higher than those of healthy controls(P<0.05). Conclusion: The effects associated with ILC2s of esophageal cancer patients are increased， and ILC2s may play an important role in the genesis and development of esophageal cancer by the secretion of effector moleculars and mediating the polarization of Th2 cells．

group 2 innate lymphoid cells； T helper 2 cells； esophageal cancer

2016- 03- 30

2016- 04- 16

国家自然科学基金资助项目(H81402004)；无锡市科技局指导性项目(CSZ00N1205)

纪勇(1981-)，男，江苏东海人，副主任医师，医学博士。E- mail:1545113644@qq.com

吴小波 E- mail:wuxb@wuxiph.com

纪勇，胡斌，朱乾坤，等.二型固有淋巴细胞相关因子在食管癌患者外周血中的表达情况分析[J].东南大学学报：医学版，2016，35(4)：502- 505．

R735.1

A

1671- 6264(2016)04- 0502- 04

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.006