RP-HPLC法测定苦豆子总碱中苦参碱与氧化苦参碱、槐果碱与氧化槐果碱含量*

陈海燕，冷晓红，郭鸿雁，李 军，郝彩琴

宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021

RP-HPLC法测定苦豆子总碱中苦参碱与氧化苦参碱、槐果碱与氧化槐果碱含量*

陈海燕，冷晓红，郭鸿雁，李 军，郝彩琴

宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021

目的:建立测定苦豆子总碱中氧化型生物碱与还原型生物碱含量的反相高效液相色谱法。 方法:采用C18键合硅胶反相柱，以乙腈-0.05 m ol/L磷酸二氢钾水溶液(三乙胺2.0 m L/L)为流动相，梯度洗脱，检测波长205 nm，柱温30℃，流速1.0 m L/m i n。结果:氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱分离良好，氧化苦参碱平均回收率为99.10%，RSD为1.15%；苦参碱平均回收率为98.76%，RSD为1.64%；氧化槐果碱平均回收率为100.12%，RSD为1.86%；槐果碱平均回收率为98.35%，RSD为2.01%。结论:所建立的测定苦豆子总碱中氧化型与还原型生物碱含量方法专属性强，灵敏度高，能有效控制苦豆子总碱质量。

反相高效液相色谱法；苦豆子总碱；氧化苦参碱；氧化槐果碱；苦参碱；槐果碱；含量测定

苦豆子Sophora aLopecuroides L.为豆科槐属多年生草本植物，生物体内含有20多种生物碱类成分［1］，药用部位主要为干燥地上部分及种子，性寒有毒、味极苦。苦豆子总碱(Total alkali Sophora alopecuroids L.，TASa)是从苦豆子的干燥全草和种子中提取的总生物碱，主要含有槐胺碱、槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱等。现代医学研究表明，苦豆子总碱具有抗肿瘤、抗菌、抗炎以及清热解毒、祛风燥湿作用［2-5］。以苦豆子总生物碱为原料生产的克泻灵片是治疗急、慢性肠炎、结肠炎的理想药品，为国家中药保护品种。此外在治疗妇科炎症、慢性乙型病毒性肝炎等方面苦豆子总碱也具有明显疗效。

苦豆子总碱原质量标准采用HPLC测定槐果碱的含量，仅仅测定单一成分槐果碱的含量难以反映苦豆子总碱中生物碱的实际含量状况，因此本实验采用HPLC法测定氧化苦参碱与苦参碱、氧化槐果碱与槐果碱含量，为制定苦豆子总碱质量标准提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent LC-1220高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，自动进样器；Mettler Toledo万分之一电子天平(上海仪器有限公司提供)。

1.2 试药 氧化苦参碱对照品(批号:110780-201007)，氧化槐果碱(批号:111652-200301)，苦参碱对照品(批号:110805-200508)均购自于中国药品生物制品检定所；槐果碱购于宁夏紫荆花药业有限公司，纯度≥98.0%。苦豆子总碱由宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心提供，为褐色的稠膏物；乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾、浓氨水为分析纯，超纯水实验室自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Agilent TC-C18(2)(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈与0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液(加三乙胺2.0 mL/L)；采用梯度洗脱，0～12 min～45 min，乙腈与磷酸二氢钾比例为6∶94～10∶90～10∶90；检测波长:205nm；流速:1.0mL/min；进样量10 μL，柱温30℃，理论塔板数以氧化苦参碱峰计不得低于10 000。

2.2 对照品溶液的制备 取氧化苦参碱对照品、氧化槐果碱对照品、苦参碱对照品和槐果碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含氧化苦参碱、氧化槐果碱约为0.16 mg，苦参碱、槐果碱约为0.12 mg的混合溶液，过0.45μm有机微孔滤膜，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图。见图1。

注:1氧化苦参碱；2氧化槐果碱；3苦参碱；4槐果碱。图1 4种生物碱对照品色谱图

2.3 供试品溶液的制备 取苦豆子总碱约0.3g，精密称定，加甲醇溶解定容至100 mL量瓶中，混匀，过0.45 μm有机微孔滤膜，得供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图。见图2。在本色谱条件下，氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱分离良好，分离度均大于1.5。按供试品溶液制备方法得阴性对照溶液，色谱实验结果表明无溶剂干扰，见图3。

图3 阴性对照色谱图

2.4 线性关系考察 分别精密称定氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含氧化苦参碱0.4448mg、氧化槐果碱0.491 7 mg、苦参碱0.421 6 mg、槐果碱0.426 4 mg的混合溶液，精密量取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.5、5.0、8.0 mL至10 mL的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进行分析。以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱的线性回归方程分别为:

线性范围分别为:22.24～355.8，24.58～393.4，21.08～337.3，21.32～341.1 mg/L，结果表明4种生物碱线性关系良好。

2.5 精密度实验 按“2.1”项色谱条件下，取混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，以峰面积进行计算，结果氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱峰面积的RSD分别为1.00%、1.56%、0.68%、0.66%。

2.6 稳定性实验 取同一苦豆子总碱样品溶液，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24小时进样10 μL检测色谱峰峰面积。结果氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱峰面积的RSD分别为1.38%、1.75%、0.68%、3.89%。表明样品溶液在24小时内稳定性良好。

2.7 重复性实验 取同一批号苦豆子总碱供试品，精密称取6份，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，测定各生物碱含量，结果氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱的RSD分别为0.38%，1.51%、1.21%、1.18%。

2.8 加样回收率实验 取同一批号已知含量的苦豆子总碱供试品6份，每份约0.15g，精密称定，将甲醇溶解后转移至100 mL量瓶中，每份样品分别精密加入氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱对照品，量与供试品中所含成分比例约为1∶1，用甲醇定容至刻度，混匀，即得加样回收率供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱与槐果碱的平均回收率分别为99.10%，100.12%、98.76%、98.35%；RSD分别为1.15%、1.86%、1.64%、2.01%。

2.9 样品含量测定 精密称取3批次苦豆子总碱样品，依法制备供试品溶液进样检测，按外标法计算生物碱百分含量，结果见表1。

表1 苦豆子总碱含量(以干燥品计算) %

3 讨论

3.1 检测波长 氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱和槐果碱在205 nm处有较大吸收，色谱峰对称性良好，故选205 nm作为检测波长。

3.2 流动相梯度洗脱 以乙腈-0.05 mol/mL磷酸二氢钾溶液(2.0 mL/L三乙胺)为流动相，考察不同梯度洗脱，1)0min→10 min→12min→45min，乙腈:磷酸二氢钾为5∶95→8∶92→10∶90→10∶90；2)0min→13min→45min，乙腈∶磷酸二氢钾为6∶94→10∶90→10∶90；3)0 min→12 min→45 min，乙腈∶磷酸二氢钾为6∶94→10∶90→10∶90。结果“3)”的洗脱效果最好，4种生物碱与邻近峰的分离度大于1.5。

苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱等是苦豆子植物的主要成分，并且氧化苦参碱、氧化槐果碱的含量高于苦参碱和槐果碱的含量［6-7］，表明在植物体内氧化苦参碱、氧化槐果碱应为较稳定的天然存在形式，且提取过程中苦参碱与氧化苦参碱、槐果碱与氧化槐果碱存在着相互转化［8-11］，因此测定苦豆子总碱含量时，不能忽略苦豆子提取过程中氧化型生物碱与还原型生物碱相互转化的影响［12-13］，所以本实验采用HPLC法同时测定氧化苦参碱和苦参碱、氧化槐果碱和槐果碱的含量，以便很好地控制苦豆子总碱质量。

［1］ 秦学功，元英进.苦豆子种子中生物碱的冷浸提取实验研究［J］.中草药，2001，32(7):604-605.

［2］ 焦河玲，邓虹珠，王晓娟，等.苦豆子总碱对S180荷瘤小鼠的抑制作用［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(2):163-165.

［3］ 周娅，杨志伟，赵建宁，等.苦豆子总碱的体外抗菌活性研究［J］.2000，22(2):79-81.

［4］ 周毅，邓虹珠，邓子华，等.苦豆子总碱对大鼠实验性结肠炎CD 4+CD 25+，CD 8+CD 28-表达的影响［J］.中国临床康复，2006，10(47):89-91.

［5］ 邢世瑞.宁夏中药志上卷［M］.2版.银川:宁夏人民出版社，2006:130.

［6］ 马玲，王俊卿，田杰.H PLC同时测定苦豆草中7种生物碱的含量［J］.中国中药杂志，2011，36(11):1483-1486.

［7］ 张福宝，狄天云，王汉卿.不同物候期苦豆籽中8种生物碱含量的变化分析［J］.宁夏医学杂志，2013，35(11):1066-1067.

［8］ 郭安.苦参碱和氧化苦参碱提取纯化工艺研究［J］.西南林学院学报，2006，26(2):37-39.

［9］ 冷晓红，陈海燕，郭鸿雁，等.不同提取方法对苦豆子中氧化槐果碱与槐果碱含量的影响［J］.西北药学杂志，2013，28(5): 457-458.

［10］肖吉元，陈有智，李平.苦豆子生物碱药理学研究进展［J］.西部中医药，2014，27(8)：165-168.

［11］郭鸿雁，冷晓红.苦豆子籽总生物碱分离纯化工艺研究［J］.西部中医药，2015，28(10)：49-52.

［12］陈建国.苦豆子总碱对大鼠实验性结肠炎SO D，M D A，N O，M PO表达的影响［J］.中国中药杂志，2006，31(4)：323-325.

［13］陈申，刘宇，强哲.苦豆子总碱对小鼠急性毒性试验研究［J］.中兽医医药杂志，2013(2)：34-36.

RP-HPLC Determination of the Contents of Matrine,Oxymatrine,Sophocarpine and Oxysophocarpine in Total Alkaloid of Sophora Alopecuraidesl

CHEN Haiyan,LENG Xiaohong,GUO Hongyan,LI Jun,HAO Caiqin
Ningxia polytechnic,Yinchuan 750021,China

Objective：To establish a RP-HPLC method for dertermination of the contents of oxyalkaloid and reduced alkaloid in total alkaloid of sophora alopecuraidesl.Methods：RP-C18bonded silica gel column was adopted, acetiontrile-0.05 mol/L potassium Bi-phosphate solution(triethylamine 2.0 mL/L was mobile phase,and gradient elution,the detection wavelength was 205nm,column temperature was 30 degrees celsius,the flow rate was 1.0mL/min.Results：Average recovery rate of matrine,oxymatrine,sophocarpine and oxysophocarpine were 99.10%,RSD was 1.15%,matrine was 98.76%;RSD was 1.64%,oxysophocarpine was 100.12%,RSD was 1.86%; sophocarpine was 98.35%,RSD was 2.01%.Conclusion：The method for dertermination of the contents of oxyalkaloid and reduced alkaloid in alkaloid of sophora alopecuraidesl is specific and highly sensitive,which can control the quality of total alkaloid of sophora alopecuraidesl effectively.

RP-HPLC;total alkaloid of sophora alopecuraidesl;oxymatrine;oxysophocarpine;matrine; sophocarpine;dertermination of contents

R284.1

A

1004-6852(2016)10-0033-03

2016-02-27

国家科技支撑计划(编号2011BA I05B00)。

陈海燕(1966—)，女，教授。研究方向:药物分析检验。