基于ITS2条形码鉴别半枝莲及其混伪品

郭梦月 任 莉 陈新连 庞晓慧

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京，100193)



基于ITS2条形码鉴别半枝莲及其混伪品

郭梦月 任 莉 陈新连 庞晓慧

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京，100193)

目的：运用Internal Transcribed Spacer 2(ITS2)条形码对半枝莲及其混伪品进行鉴别研究，为该药材的安全用药提供依据。方法：提取样品基因组DNA，对ITS2序列进行PCR扩增和双向测序，所得序列经CodonCode Aligner V5.0.2.0拼接，采用MEGA6.0软件进行序列比对，计算种内和种间遗传距离。采用最近距离法(Nearest Distance)和构建邻接树(NJ Tree)分析ITS2条形码对半枝莲的鉴定能力。结果：半枝莲ITS2序列种内遗传距离为0～0.008 4，与其混伪品半边莲、韩信草和荔枝草的种间遗传距离分别为0.354 7～0.369 6、0.044 2～0.054 2、0.271 9～0.301 8。半枝莲种内最大遗传距离小于其与混伪品的种间最小遗传距离，表明ITS2条形码可以准确鉴定半枝莲与其混伪品。基于ITS2序列构建的NJ树也可将半枝莲及其混伪品明显区分开。结论：ITS2序列可以快速、准确鉴别半枝莲与其混伪品，是鉴别半枝莲、保障其药材质量的有效条形码。

半枝莲；ITS2；DNA条形码；分子鉴定

半枝莲为常用中药，具有清热解毒，化瘀利尿的功效，用于治疗疔疮肿毒、咽喉肿痛、跌扑伤痛、水肿、黄疸及蛇虫咬伤[1]。现代药理学研究表明，半枝莲具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌等多种药理活性作用[2-6]，在临床上可用于治疗肺癌、乳腺癌、直肠癌等[7-9]。半枝莲药材来源为唇形科植物半枝莲ScutellariabarbataD.Don的干燥全草，然而其常见混伪品半边莲LobeliachinensisLour.、韩信草ScutellariaindicaL.和荔枝草SalviaplebeiaR.Br.常与其混用[10]，导致用药安全存在隐患。其混伪品韩信草、荔枝草和半枝莲同属唇形科植物，具有茎方形相似形态，易于混淆[11]。混伪品半边莲来源为桔梗科植物半边莲的干燥全草，二者虽亲缘关系较远，形态差异相对较大，但由于其名称和功效都相近，药用部位也相同，在实际应用中经常发生混淆[12]。这些混伪品与半枝莲的功效和化学成分都存在差异，若在临床使用中混用或错用，将对临床用药安全构成威胁。为了将半枝莲及其混伪品更好的区分开，保证临床用药的安全有效，急需一种准确快速的鉴定方法。

利用DNA条形码技术进行物种分类和鉴定已经成为近年来的研究热点[13]。较传统经验鉴别而言，DNA条形码鉴定技术不受药材性状、鉴别经验的影响，可直接从基因水平快速准确地区分药材及其混伪品，具有高效、操作简单的优点[14]。Chen等经过大量样本研究建立的以ITS2为核心，psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系已被纳入中国药典(2010年版)增补本[15]。ITS2序列具有适宜扩增和测序的长度，且鉴定成功率高，其鉴定能力已在豆科[16]、蔷薇科[17]、菊科[18]、芸香科[19]等多个科属中得到验证。目前，ITS2条形码已广泛应用于中药材鉴定[20-40]。本研究采用ITS2条形码对半枝莲及其易混淆品进行DNA条形码鉴别研究，为半枝莲的准确鉴定提供依据。

1 材料

本研究共收集实验材料34份，其中半枝莲样品26份，包括药材16份，种子10份；其混伪品样品8份，包括半边莲7份，韩信草1份。样品收集于河北、安徽、四川、江苏、北京等地，凭证标本经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，并保存于中国医学科学院药用植物研究所。另外，从GenBank下载ITS2序列6条，分别为半边莲2条，韩信草2条，荔枝草2条。样本信息详见表1。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR扩增及测序 半枝莲及其混伪品药材各挑选叶片部分，称取约30 mg；半枝莲种子称取60 mg，加入样本量10%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用DNA提取研磨仪(Retsch MM400，德国)研磨2 min(30次/s)，采用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA。扩增ITS2序列，正向引物：ITS2F：5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向引物：ITS3R：5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。扩增体系及程序参照“中药材DNA条形码分子鉴定指导原则”[14]，PCR扩增产物委托中国农业科学院进行双向测序。

2.2 数据处理 测序峰图利用CodonCode AlignerV5.0.2.0(CodonCode Co.，USA)校对拼接。所得序列及GenBank下载序列基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S区段。将所有序列用软件MEGA6.0分析比对，并基于K2P模型进行遗传距离等分析。所得序列采用最近距离法(nearest distance)、构建邻接树(NJ Tree)对序列鉴定能力进行评估。

3 结果

3.1 半枝莲及其混伪品ITS2序列特征分析 半枝莲25条ITS2序列的长度均为241 bp，GC含量为68.9%～69.3%，半枝莲种内序列间存在2个变异点，分别为59位点G-A变异，229位点G-A变异，分为3个单倍型。混伪品半边莲、韩信草和荔枝草ITS2序列长度分别为246bp、234bp和228bp，GC含量分别为66.3%～67.2%、67.1%～67.9%和61.4%～62.3%。半枝莲与半边莲、韩信草及荔枝草存在较多变异位点。见图1。

表1 样本信息

图1 半枝莲及其混伪品的种间变异位点

3.2 半枝莲及其混伪品种内及种间遗传距离分析 半枝莲ITS2序列种内最小遗传距离0，最大遗传距离为0.008 4。半边莲、韩信草和荔枝草ITS2序列种内遗传距离分别为0～0.012 4、0～0.004 3、0.008 8。半枝莲与半边莲、半枝莲与韩信草以及半枝莲与荔枝草之间的遗传距离分别为0.354 7～0.369 6、0.044 2～0.054 2、0.271 9～0.301 8(表2)。半枝莲与其混伪品种间最小遗传距离大于半枝莲种内最大遗传距离，说明采用ITS2序列可以将半枝莲与其混伪品准确区分开。

3.3 构建NJ树鉴别半枝莲及其混伪品 从基于ITS2序列构建的NJ树图(图2)可以看出，半枝莲单独聚为一支，支持率为96%，表现出单系性。混伪品半边莲、韩信草及荔枝草各自聚为一支，明显与半枝莲分开。因此，ITS2条形码可准确鉴别半枝莲药材及其混伪品。

图2 基于ITS2序列构建的半枝莲及其混伪品NJ树

4 讨论

4.1 半枝莲混淆现象多见 半枝莲为常用中药，在临床上有广泛应用。然而，有文献报道半边莲、韩信草和荔枝草等中药材常与其混淆使用[10]，严重影响药材质量。韩信草、荔枝草与半枝莲同来源于唇形科且药用部位相同，具有相似的茎四棱的植物学特征，在采收和使用过程中均易发生混淆。半边莲与半枝莲形态特征差异较明显，与其他混伪品相比较，易于与半枝莲进行区分。然而，我们的研究发现半边莲却是半枝莲更为常见的混伪品，本研究中收集于广西药店的BABL0007号样品，购买时标签注明为半枝莲，通过序列比对进行判定并经过NJ树验证，结果证明该样品并非半枝莲，而是半边莲，可见半枝莲和半边莲因其名称相近，在使用中的确易于发生混淆。

4.2 ITS2条形码可从种子源头控制半枝莲质量 获得样品DNA以及扩增得到条形码序列是成功运用DNA条形码技术的前提。种子类实验材料多含有大量油脂，存在难以粉碎和裂解的问题[36]。张娜娜等[37]在加裂解液GP1后，以65 ℃水浴4 h的条件对泽泻种子进行DNA提取。马双姣等[38]在王不留行种子粉碎前加入相当于药材量5%的PVP，粉碎后加人核分离液700 μL漂洗2～3次，65 ℃水浴3 h提取DNA。本研究在提取半枝莲种子DNA时，在粉碎前加入样本量10%的PVP，加裂解液GP1后56 ℃水浴过夜，后续按照试剂盒说明书步骤进行操作，成功对所有半枝莲种子DNA进行提取和PCR扩增，说明半枝莲种子DNA易于提取。在收集的10份种子样品中，9份样品鉴定结果为半枝莲，BAZL0026号样品鉴定结果为旋花科的南方菟丝子，未发现常见混伪品韩信草、荔枝草和半边莲的种子。南方菟丝子不是半枝莲的常见混伪品，亲缘关系也非常远，仅仅是大小相似，就造成了种子混淆，说明半枝莲药材种子混淆问题存在且很严重，急需解决。中药材种类繁多，鉴别困难，对其种子进行准确鉴别更是难上加难，因此种子比药材更易混淆。然而，在种子源头发生混淆将直接导致中药材的错种和错收，会严重影响药材质量和用药安全，而且会造成经济上的大量损失。ITS2条形码的成功应用，能有效避免半枝莲种子在流通环节混伪现象的发生，从根源上保证药材的质量。

4.3 ITS2条形码可有效鉴别半枝莲药材及其混伪品 ITS2条形码在多种植物类中药材及其混伪品的鉴定中显示出了较好的物种鉴定能力，涵盖根及根茎类[20-23]、叶类[24-25]、茎木类[26-28]、皮类[29-31]、全草类[32]、花类[33]及果实及种子类[34-35]等中药材。本研究成功提取了半枝莲及其混伪品药材的DNA，且所有实验样本的PCR扩增、测序成功率及序列获得率均为100%。实验结果表明半枝莲的种内最大遗传距离小于与其混伪品的种间最小遗传距离，NJ树中半枝莲及其混伪品都能很好的各自聚为一支，与其混伪品能明显分开，说明ITS2条形码是对半枝莲及其混伪品进行准确快速鉴定的好工具，也再次证实了DNA条形码对中药材物种鉴定的能力。DNA条形码对半枝莲及其混伪品鉴别的高度准确性，为规范中药材半枝莲的市场流通，保障临床用药安全及疗效提供了参考依据，也为全草类中药材的鉴别提供了新的手段。

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(2016-04-12收稿 责任编辑：洪志强)

Identification of Scutellariabarbata and its adulterants using ITS2 barcode

Guo Mengyue，Ren Li，Chen Xinlian，Pang Xiaohui

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193,China)

Objective:To discriminate betweenScutellariabarbata and its adulterants using ITS2 barcode to provide evidence for its clinic safety.Methods:The DNA was extracted from the samples and the second internal transcribed spacer(ITS2)was amplified and sequenced.Sequence assembly was performed using the CodonCode AlignerV5.0.2.0.The genetic distances and variable sites of ITS2 region were analyzed using MEGA6.0 after sequence alignment.Nearest distance and neighbor-joining tree(NJ-tree)methods were used to test the identification efficiency of the ITS2 barcode.Results:The intraspecific genetic distances ofS.barbata were 0～0.0084，while the interspecific genetic distances between S.barbata and its adulterants were 0.3547～0.3696,0.0442～0.0542，and 0.2719～0.3018，respectively.The maximum intraspecific genetic distance of S.barbata was lower than the minimum interspecific genetic distance between S.barbataand its adulterants，which indicates that ITS2 barcode could discriminate S.barbata and its adulterants accurately.The NJ tree based on ITS2 sequences also reveals that S.barbata and its adulterants could be obviously identified.Conclusion:S.barbata could be accurately distinguished from its adulterants using ITS2.The ITS2 region is an efficient barcode to guarantee the quality of medicines.

Scutellariabarbata; ITS2; DNA barcode; Molecular identification

国家自然科学基金面上项目(编号：81573541)

庞晓慧(1983—)，女，博士，副研究员，从事中药分子鉴定研究，Tel：(010)57833051，E-mail：xhpang@implad.ac.cn

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.010