白芍饮片标准汤剂质量标准研究

朱广伟 李西文 陈士林

(中国中医科学院中药研究所，北京，100700)



专题——现代生物学技术在中药资源研究中的应用

白芍饮片标准汤剂质量标准研究

朱广伟 李西文 陈士林

(中国中医科学院中药研究所，北京，100700)

目的：制备白芍饮片标准汤剂，并进行质量标准研究。方法：以水为溶剂，以标准化工艺制备标准汤剂，采用UPLC-DAD法测定芍药苷含量，并进行转移率、出膏率计算及指纹图谱研究。结果：10批次白芍样品制成的标准汤剂中芍药苷含量为1.69～2.60 mg/mL，转移率为60.47%～85.16%，平均转移率为71.62%，标准偏差为8.74%。出膏率范围为19.00%～26.50%，平均出膏率为21.89%，标准偏差为2.51%。指纹图谱共有峰11个，确认5个，分别是：氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷。结论：本方法处理样品简单，重复性好，可用于白芍标准汤剂的制备及质量标准研究。

白芍；饮片；标准汤剂；指纹图谱

白芍为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，主产于安徽、浙江、四川、山东等地。白芍饮片呈圆形薄片，气微，味微寒、酸，含有芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷[1-5]等，具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛[6-8]，平抑肝阳的功效，用于治疗月经不调，胁痛，腹痛，四肢挛急[9-10]等症。本研究以市售5个产地(湖南、安徽、山东、浙江、四川)10批次白芍饮片为材料，以标准化工艺制备白芍饮片标准汤剂[11]，考察含量、转移率、出膏率范围，及指纹图谱研究，为规范根及根茎类饮片的煎煮工艺流程，为白芍饮片标准汤剂质量标准的制定提供基础研究数据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290高效液相色谱仪，HP真空脱气泵，HP四元泵，HP自动进样，HP柱温箱，UPLC-DAD检测器；WRX-1S型BP110S电子分析天平；Thermo-18色谱柱(1.5 mm×210 mm，2.6 μm)。

1.2 受试药物 芍药苷(含量≥98%，批号130815)，购自成都普菲德生物技术有限公司。白芍购自河北省安国药材市场，分别产自湖南(一等品至三等品)、安徽亳州(一等品至四等品)、浙江、山东、四川，经DNA条形码技术鉴定均为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根。见表1。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇配制成含芍药苷0.54 mg/mL的对照品溶液，至于冰箱中，4 ℃保存，备用。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 白芍饮片 乙醇提取液制备精密称取表1各批次白芍饮片5 g，按照2015版《中华人民共和国药典》制备各样品溶液。

表1 样品来源

2.2.2 白芍饮片标准 汤剂的制备精密称取表1各批次白芍饮片100 g，分别加7倍量的水，先浸泡30 min，煮沸60 min，过滤分离出煎煮液，最后再加6倍量水煎煮40 min。合并煎煮液，浓缩成500 mL溶液，即浓度为0.2 g/mL的原药材溶液，取该浓缩液1 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，静置20 min，分出上清液，即得供试品，进样前用0.45 μm滤膜过滤。

2.3 色谱条件 色谱柱为Thormo-18色谱柱(2.1 mm×150 mm，2.6 μm)；流动相为乙腈(B)-0.1%醋酸水溶液(A)，梯度洗脱，0～6 min，5%～15%B，6～11 min，15%～20%B，11～15 min，20%～25%B，15～21 min，25%～40%B，21～26 min，40%～50%B，26～27 min，50%～95%B，体积流量0.4 mL/min，进样量3 μL，柱温30 ℃，检测波长为230 nm，色谱如见图1，图2。

图1 芍药苷对照品UPLC-DAD色谱图

图2 白芍饮片标准汤剂UPLC-DAD色谱图

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1”中对照品溶液0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL分别加到5 mL容量瓶中，定容至刻度。按2.3色谱条件测定各成分的峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，对照品进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见图3。

图3 芍药苷标准曲线

2.5 精密度考察 取同一批白芍供试品溶液，按照2.3色谱条件进样，连续6次，测定并计算芍药苷峰面积的RSD值。RSD分别为0.4%，表明仪器精密度良好。见表2。

表2 精密度试验结果

2.6 稳定性试验 精密称取白芍饮片适量，制备供试品溶液，按照2.3色谱条件进样，分别于配制后0，4，8，10，12，24 h进样，测定并计算芍药苷峰面积的RSD值。RSD分别为1.3%，表明24 h内供试品溶液稳定性良好。见表3。

表3 稳定性试验结果

2.7 重复性实验 精密称取白芍饮片适量,平行制备6批次供试品溶液，按照2.3色谱条件进样，测定并计算芍药苷峰面积的RSD值。RSD为1.4%，表明本方法重复性良好。见表4。

2.8 加样回收率试验 精密称取同一批已知含量的供试品，分别精密加入等量药苷对照品，按照色谱条件测定含量，计算芍药苷的平均回收率为98.5%，RSD值为1.4%。见表5。

3 结果

3.1 转移率及出膏率考察

3.1.1 白芍饮片及标准汤剂中芍药苷含量测定 分别精密吸取2.2.1中各溶液1 μL进样，按照2.3色谱条件测定峰面积，根据外标法计算白芍饮片中芍药苷含量。见表6。

分别精密吸取2.2.2中供试品溶液各5 μL进样，按照2.3色谱条件测定峰面积，根据外标法计算标准汤剂中芍药苷含量，结果见表6。

表4 重复性试验结果

表5 加样回收率试验结果

表6 白芍饮片及标准汤剂中芍药苷含量

3.1.2 芍药苷转移率 根据3.1.1测定结果，按照转移率计算公式计算芍药苷转移率，转移率计算公式为：

转移率(%)=W(mg)/M(mg)×100%

注：W表示汤剂中芍药苷的量(mg)，M表示饮片中芍药苷的量(mg)。

3.1.3 标准浸膏出膏率计算结果 精密吸取混合均匀的2.2.2供试品溶液10 mL于蒸发皿中，40 ℃真空干燥至恒重，称量重量，根据出膏率公式计算标准汤剂出膏率。见表8。

出膏率(%)=(w×V)/(v×M)×100%

注：M表示药材量(g)，V表示中药饮片标准汤剂体积(mL)，v表示取样体积(mL)，w表示取样所得干膏量(g)。

表7 芍药苷转移率计算结果(±s)

表7 芍药苷转移率计算结果(±s)

样品编号转移率(%)x±sBS0177.96%BS0265.61%BS0375.29%BS0462.03%BS05BS0660.47%64.47%71.62%±8.74%BS0781.69%BS0876.51%BS0967.02%BS1085.16%

表8 标准汤剂出膏率计算结果(±s)

表8 标准汤剂出膏率计算结果(±s)

样品编号出膏率(%)x±sBS0123.60%BS0222.50%BS0322.10%BS0419.00%BS05BS0620.00%20.00%21.89%±2.51%BS0725.00%BS0820.50%BS0919.68%BS1026.50%

3.2 白芍饮片标准汤剂UPLC-DAD指纹图谱研究

3.2.1 指纹图谱的建立及共有峰的标定 按照“2.3”色谱条件分别将10批次白芍饮片标准汤剂供试品溶液进样分析，准确吸取各供试品溶液5 μL，注入UPLC记录色谱峰信息。见图4，生成的对照指纹图谱见图5。其中共有峰11个，通过UPLC-ESI-MS/MS指认5个，分别是1号峰：氧化芍药苷(Rt=4.661)；2号峰：儿茶素(Rt=5.696)；3号峰：芍药内酯苷(Rt=6.447)；4号峰：芍药苷(Rt=7.102)；11号峰：苯甲酰芍药苷(Rt=18.709)。见表9。

图4 10批白芍样品UPLC-DAD指纹图谱

图5 共有峰及其化学归属

3.2.2 相对保留时间及相对峰面积 对照指纹图谱中，以芍药苷色谱峰的保留时间和峰面积为1，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表10。3.2.3 指纹图谱相似度评价 运用“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”软件，经过数据导入，峰点校正和数据匹配，以中位数法建立对照指纹图谱。根据峰匹配结果，以峰面积为参数，计算出待测指纹图谱与对照图谱的整体相似度，结果表明，相似度均大于0.9，符合指纹图谱相似度要求。具体计算结果如下：S1：0.984；S2：0.978；S3：0.981；S4：0.984；S5：0.989；S6：0.987；S7：0.987；S8：0.988；S9：0.973；S10：0.981。

表9 主要色谱峰的归属

4 结果

通过对入选的10批次白芍进行含量测定，各批次的芍药苷含量均符合药典的要求(芍药苷含量≥1.2%)，含量分别为：湖南一等1.48%、湖南二等1.29%、湖南三等1.22%、亳州一等2.07%、亳州二等2.01%、亳州三等1.91%、亳州四等1.59%、浙江1.34%、山东1.56%、四川1.52%。从数据看，各产地的白芍指标成分含量存在一定的差异，亳州一等质量最优，为药典最低值1.725倍。

选定的符合药典含量要求的白芍饮片(芍药苷含量1.34%～2.07%)，按照标准化工艺制备成的标准汤剂指标成分含量为1.69～2.60 mg/mL，转移率为60.47%～85.16%，平均转移率为71.62%，标准偏差为8.74%。出膏率范围为19.00%～26.50%，平均出膏率为21.89%，标准偏差为2.51%。

通过分析可以看出，作为原材料的饮片，其质量优劣与汤剂含量、转移率、出膏率并无明显的线性关系(图6)，通过比较发现，饮片的切制方式、质地疏松度也是影响这些指标的重要因素。因此，工业生产时，既要考虑到饮片质量，还要考虑到饮片的加工方式等因素。

表10 各共有峰相对保留时间和相对峰面积

图6 饮片含量、汤剂含量、转移率、出膏率趋势图

通过对10批次白芍饮片标准汤剂的指纹图谱研究发现，汤剂的指纹图谱相似度较高，均达到0.9以上，共有峰总计11个，确认5个，包括氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷，5个峰的相对保留为0.66∶0.80∶0.91∶1.00∶2.63；相对峰面积为0.06∶0.01∶0.32∶1.00∶0.01。

5 讨论

中药饮片标准汤剂作为一种标准物质和标准体系，是对传统汤剂煎煮工艺的传承和创新，传统汤剂在煎煮时一般没有固定的加水量、煎煮时间、浓缩体积等，大多根据经验操作，如《伤寒论》中有记载：“……右二味，以水三升，煮取一升五合……”；又有记载“……右六味，以水七升，煮取三升……”，传统煎煮方法也没有明确的时间计量，一般以加水量及浓缩体积来控制煎煮时间，如将三升水煎煮至一升五合时即可停止煎煮，以此进行时间计量，这种粗略的计算原则不利于中药现代化，更无法保证汤剂质量标准的制定及临床给药剂量的均一性。现代煎煮规范虽对不同部位、不同功效的饮片加水量、煎煮时间作了细化，如加水量“浸过药面2～5 cm”，煎煮时间“一般药物20～30 min；解表、清热、芳香类15～20 min；滋补类40～60 min；二煎时间比头煎略缩短”，但数值范围较宽，容易受人为因素影响而产生较大误差。

中药饮片标准汤剂既传承了按照药用部位的不同，设计不同层次的加水量，如：根及根茎类饮片首煎加7倍水，二煎加6倍水。同时也根据功效的差异及饮片的特质设计不同煎煮时间，如：一般饮片，头煎30 min，二煎20 min；对于质地坚硬、滋补类饮片，头煎60 min，二煎40 min，从根本上解决了工艺不统一的问题，解决了以往因煎煮工艺的不同，而导致用药剂量无法统一的现状，为规范根及根茎类饮片的煎煮工艺流程，为白芍饮片标准汤剂质量标准的制定提供基础研究数据。同时，中药饮片标准汤剂对于生产配方颗粒具有重要的指导作用，对于同种饮片，由于给定了具体的操作规范，可以从根本上减少不同批次、不同厂家间产品的差异，确保质量的均一性，保障了用药安全及临床疗效。

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(2016-04-12收稿 责任编辑：洪志强)

Quality standard research on standard decoction of paeonialactiflora

Zhu Guangwei，Li Xiwen，Chen Shilin

(InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicinalSciences，Beijing100700，China)

Objective:To study the preparation and quality standard of the standard decoction of paeonia lactiflora.Methods:The standard decoction of paeonia lactiflora was preparated with water by using standardization method and the content of peoniflorin was determined by UPLC-DAD.Then calculate the transfer rate,the rate of extractum and carry on the research of fingerprint.Results:The content of paeoniflo-rin in 10 batches of standard decoction of paeonia lactiflora is 1.69～2.60 mg/mL，the transfer rate is 60.47%～85.16%，the average transfer rate is 71.62% and the standard deviation is 8.74%.The rate of extractum is 19.00%～26.50%，the average yield is 21.89% and the standard deviation is 2.51%.There were 11common peaks，5 of which were identified，including oxypaeoniflorin，catechins,albiflorin，paeoniflorin and benzoylpaeoniflorin.Conclusion:The method is simple with good repeatability，and it can be used to study the preparation of the standard decoction of paeonia lacti-flora.

Paeonia lactiflora; Medicinal slices; Standard decoction; Fingerprint

中国中医科学院综合性大平台项目(编号：Z2014003-05)

朱广伟，博士，助理研究员，研究方向：中药药效物质基础研究、中药药效组分评价体系研究，E-mail：gwzhu@icmm.ac.cn

陈士林，博士研究生导师，主要从事中药资源学研究，Tel：(010)57203877，E-mail：slchen@icmm.ac.cn

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.001