鳗鲡肌肉中孔雀石绿代谢物隐性孔雀石绿染料残留标准物质的研制

尹太坤，杨 方，刘正才 ，林永辉

( 1.福州大学 石油化工学院 福建 福州 350108； 2.福建出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，福建 福州 350001 )

鳗鲡肌肉中孔雀石绿代谢物隐性孔雀石绿染料残留标准物质的研制

尹太坤1，杨 方2，刘正才2，林永辉2

( 1.福州大学 石油化工学院 福建 福州 350108； 2.福建出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，福建 福州 350001 )

为建立鳗鲡肌肉中孔雀石绿代谢物隐性孔雀石绿染料残留标准物质的研制和定值方法，以一定质量浓度孔雀石绿对鳗鲡进行药浴给药，使孔雀石绿在鱼体内自然代谢，从而使鳗鲡体内含有隐性孔雀石绿残留。经均质、真空包装及辐照处理后，获得一批500个独立包装的的鳗鲡肌肉样本。采用超高效液相色谱-串联质谱法对该样本进行均匀性和稳定性检验，经8家独立实验室协同定值及不确定度评估，其特性值为2.82 μg/kg，扩展不确定度为0.39 μg/kg(k=2)。所建立的制备方法为染料残留鳗鲡基体标准物质的实验室制备提供了一种参考。

鳗鲡肌肉；隐性孔雀石绿；残留；标准物质

标准物质是具有一种或多种足够均匀和很好地确定了的特性值，用于校准设备、评价测量方法或给材料赋值的材料或物质[1]，在保证分析方法的准确性及可溯源性方面具有重要作用[2]。标准物质分为纯品标准物质和基体标准物质两类，后者的候选材料获取于天然基体，目标物和基体结合情形与真实检测样品完全一致，在分析中可有效避免基体效应对物质成分分析的影响。

孔雀石绿属三苯甲烷类染料，曾作为驱虫剂和杀菌剂广泛应用于水产养殖业，其在生物体内会代谢为隐性孔雀石绿[3]。隐性孔雀石绿具有较高的亲脂性，在鱼类脂肪组织中代谢速度较慢，会形成稳定残留并有明显的蓄积现象[4-5]。由于孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿具有致癌性、高毒性、高残留的特点[6-10]，美国、日本、欧盟等国家已禁止孔雀石绿在水产品中使用, 我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》 中严禁使用。因此，孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿已成为残留检测实验室日常检测项目，开展食品中残留监控具有重要意义。

近年来有报道关于含药物残留的动物源基体标准物质的研制[11-15]，但尚未见含孔雀石绿代谢物隐性孔雀石绿染料残留的鳗鲡(Anguillajaponica)肌肉基体标准物质。本文介绍了以鳗鲡肌肉为基体的含孔雀石绿代谢物隐性孔雀石绿的标准物质的研制过程，该标准物质已在实际工作中得到应用，用于检测结果的质量控制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters UPLC/Premier超高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源(美国Waters公司)；直线电子加速器(同方威视IS075型，7.5 MeV，5 kW)；匀浆机(丹麦FOSS公司)；拍击均质器(英国Seward公司)；Bond Elut 氧化铝SPE固相萃取柱(中性，安捷伦科技有限公司)。

隐性孔雀石绿标准品(纯度≥98.5%)和隐性孔雀石绿-D6氚代同位素内标(纯度≥99.8%)，均购于德国 Dr.Ehremstorfer公司；乙腈为色谱纯，购于德国Merck公司；包装材料：铝箔复合材料平口袋为外包装，聚乙烯平口袋作内袋。

1.2 自然污染样本的制备

选取约250 g已确认不含目标物的鳗鲡，于养殖箱中养殖，水温20～22 ℃，采用空气泵24 h增氧。配制质量浓度约为0.03 mg/L的孔雀石绿溶液，以全池喷洒方式给药，用药3 d后采集阳性样本，均质混匀，制成肉糜。采用双层复合袋独立真空包装，每袋约15 g，粘贴样品标签，获得独立包装样本500个。

1.3 样品均匀性与稳定性检验

随机抽取15份独立包装样品，取样量为2 g，以每个样品3次重复测试数据为一组，每种药物共15组45个数据，采用单因素方差分析法(F-检验)检验样品的均匀性。

稳定性检验分为长期稳定性和短期稳定性进行，长期稳定性共进行7个月，每月取样1次，每个样品重复检测3次，以平均值作为检测结果。短期稳定性通过模拟样品运输条件，利用F-检验法对检测结果的均匀性进行评价。

1.4 定值及溯源性

本批标准品由8家认可实验室为本残留质量控制样品协同定值，检测数据经夏皮洛—威尔克检验[16]、柯克伦检验及格拉布斯检验[17]后取平均值进行定值。特性值不确定度UCRM参照《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》[18]进行评估。

标准物质在空间上具有溯源量值的功能[19]。本研究选择的溯源路线是，用有证标准物质内标法定量确定含量，通过有证标准物质溯源到基准单位[20]。以有证标准物质配制的隐形孔雀石绿标准溶液制作校准曲线；测量前对所有计量仪器(分析天平、容量瓶、移液枪等)进行了校准，考虑其示值不确定度；分析方法采用《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》[21]；具有资质的8家实验室根据检测情况选用不同的已被证实的检测方法定值等，保证了结果的准确性和溯源性[22]。

1.5 样品的分析方法

按《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》[21]检测样品中隐性孔雀石绿残留量。采用乙腈超声提取，经中性氧化铝柱净化后，超高效液相色谱-串联质谱法测定，同位素内标法定量。检测离子对m/z：331.3/315.7(定量)、331.3/239.5(定性)、337.3/240.2(LMG-D6)。

2 结果与分析

2.1 鳗鲡体内药物代谢

进行鳗鲡给药试验，连续药浴2 d后停用药物，清洗水池，换100%清水(不含药物)养殖。经取样检测，鳗鲡肌肉中隐性孔雀石绿的残留量随药后时间的变化趋势见图1。随时间的推移，血液和鳗鲡肌肉中隐性孔雀石绿的残留量均先升后降。空白样本于施药前采集，阳性样本的采集时间考虑到预期质量浓度范围，选择药后第3 d采集自然污染样本。将空白样本与阳性样本分别宰杀，去头、放血、除去内脏和鱼皮，置于冰柜-18 ℃冷冻保存。

图1 鳗鲡肌肉中隐性孔雀石绿残留量随药后时间变化

2.2 样本的制备

将鳗鲡肌肉切段(每段长约2 cm)置于匀浆机中，3000 r/min 转速搅成糜样并匀浆5 min；以4 kg/次的鳗鲡肌肉量搅拌3次，混合后再于大桶中人工搅拌20 min；再采用拍击式均质器进行二次混匀：将样品装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180拍/min的频率，每次拍击5 min后取出，再进行更换拍击，如此反复拍击3次。对阳性肌肉样本，采用捣碎匀浆、拍击均质和人工搅拌相结合的工艺，保障了样本的均匀性。选用聚乙烯平口袋为内袋，铝箔复合材料为外袋的双层包装袋进行真空包装后，对样本进行60Co-γ辐照灭菌，有效延长了保质期。辐照前后样本中隐性孔雀石绿残留量见表1，结果表明经60Co-γ辐照后，鳗鲡基体中隐性孔雀石绿基本不降解，辐照后目标物含量仍处于预期质量浓度范围内。

表1 60Co-γ辐照对鳗鲡肌肉中隐性孔雀石绿残留量的影响

2.3 样品谱图

0.5 μg/kg 隐性孔雀石绿标准溶液的色谱图见图2a；阳性样本按1.5前处理后上机检测，得到离子监测色谱图(样本含量2.91 μg/kg)见图2b。由图2可见，各离子对的峰形良好，且目标物出峰处无杂峰干扰，方法检出限为0.5 μg/kg，由此可见，制备的鳗鲡肌肉中隐性孔雀石绿的质量浓度适当。

图2 标准溶液(a) 及样品(b)的选择离子监测色谱图

2.4 均匀性检验

随机抽取15份独立包装样品，每个样品平行检测3次。以每袋含量的平均值作为对袋序号的函数来研究样品制备中的趋势和分装过程的逻辑关系(图3)。由此可见样品制备中的趋势稳定；分装均一，数据稳定。

对检测结果采用单因素方差分析法(F-检验)进行统计分析，方差分析结果见表2。F值=1.1820.05，表明显著水平α=0.05时，其结果均未见显著差异，从而可以判定所研制的基体标准物质是均匀的。

图3 样本均匀性检验数据平均值

表2 鳗鲡肌肉中隐形孔雀石绿残留量的均匀性方差分析

2.5 稳定性检验

2.5.1 短期稳定性

短期稳定性试验模拟样品运输条件，将样本分别置于-70 ℃、4 ℃、室温、阳光下曝晒条件下保存14 d后测定，考察短周期稳定性。每个样品重复测试3次，采用单因素方差分析法，分析结果见表3。在显著水平α=0.05时，F=0.501

表3 短期稳定性方差分析

2.5.2 长期稳定性

《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》[18]提供了2种检验方法，余孔捷等[12,14-15]采用F检验法检验一元线性回归模型的显著性，通过评估回归方差，检验MSreg与s2比值的显著性，对于95%的置信水平，当P≥0.05时，表示回归不显著，判定为样品稳定。杨丽君等[23]采用t检验法，通过误差分析计算回归参数b1(斜率)的标准偏差s(b1)，当满足|b1|0.05，表示回归不显著，从而可以判定所研制的基体标准物质在7个月内是稳定的。目前该标准物质的稳定性试验仍在继续监控。

表4 隐性孔雀石绿长期稳定性测定结果(n=3) μg/kg

表5 长期稳定性方差分析

3 讨 论

3.1 协同定值与离群值检验

本批标准品采用多实验室协同定值的方案，大连出入境检验检疫局、浙江出入境检验检疫局、河北出入境检验检疫局、广西出入境检验检疫局、厦门出入境检验检疫局、深圳出入境检验检疫局、福建中检华日有限公司、福建省产品质量检验研究院8家具有检测资质的机构共同定值，分别用1～8编号表示。虽检测环境、仪器条件、检测人员不同，但均采用液相色谱-串联质谱法进行测定(n=3)，每个实验室检测结果见表6。

表6 协同定值 μg/kg

为保准后续定值的准确性，需对8家实验室的检测值进行离群值检验，剔除无效数据。杨方等[11-12,15]在定值前对各实验室的检测值进行了柯克伦检验及格拉布斯检验。对离群值进行检验之前，需对检测数据进行正态分布检验[14,22]。本研究为保证各实验室的检测值无异常值，依次采用了夏皮洛-威尔克检验、柯克伦检验及格拉布斯检验进行检验。

3.1.1 正态分布检验

检验偏离正态分布的方法有图文法、有方向检验、多方向检验、夏皮洛-威尔克检验及爱泼斯—普利检验等，参考《数据的统计处理和解释-正态性检验》[16]，根据8家实验室的检测数据的情况，选取夏皮洛-威尔克检验，n=24且P=α=0.05时P的分位数为0.916，计算得W值为0.970>0.916，所以在显著性水平α=0.05上不拒绝零假设，即数据符合正态分布。

3.1.2 柯克伦检验

参考《测量方法与结果的准确度第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》[17]，对8个参加协同定值的实验室提供的数据进行柯克伦检检。柯克伦准则严格应用在所有标准差都是在重复性条件下，且由相同数目的测试结果计算的情形。给定P个由相同的n次重复测试结果计算的标准偏差Si(表6)，在P=8，n=3时，柯克伦的临界值为C0(1%)=0.615，C0(5%)=0.516，8个实验室的柯克伦检验的结果为0.3060，即C=0.3060<0.516[C0(5%)]，则8个实验室检测结果无异常值，均可参与后续检验。

3.1.3 格拉布斯检验

柯克伦所检验是对实验室内变异的检验，仅对应于一组标准差中的最大值，即单侧离群值检验，而格拉布斯检验主要是对实验室间变异的检验，因此有必要依次对8个实验室的均值分别进行单值和双值格拉布斯检验[17]。

在P=8时，单值格拉布斯检验的临界值G1(1%,8)=2.274，G1(5%,8)=2.126，而8家实验室的单值格拉布斯检验结果G11=1.3206，G1p=1.5982，均

在P=8时，双值格拉布斯检验的临界值G2(1%,8)=0.0563，G2(5%,8)=0.1101，而双值格拉布斯检验结果G21=0.4238，G2p=0.4127，均>G2(5%,8)，因此所有单元的数据均为正确值，均可参与后续定值。

3.1.4 定值

数据经正态检验、柯克伦检验及格拉布斯检验，所有单元的数据均可保留并参与最终定值，定值结果为2.82 μg/kg。

3.2 不确定度评定

特性值不确定度UCRM的评定参照《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》[18]，由于本批次采用邮政网络协同定值，因短期运输所引起的不确定度usts已包含在各实验室的检测值中，不用再单独计算。故本批次标准品的不确定度来源由3部分组成：测定值标准不确定度uchar、瓶间标准不确定度ubb、长期稳定性标准不确定度ults。

3.2.1 测定值标准不确定度uchar

包括实验室检测环境、仪器条件、检测方法、检测人员不同等产生的不确定度，各实验室检测结果平均值的标准偏差s=0.3392；即定值不确定度

3.2.2 瓶间标准不确定度ubb

瓶间不均匀性产生的不确定度

式中瓶间标准偏差的平方

重复性标准偏差

3.2.3 长期稳定性标准不确定度ults

本批次标准品进行了为期7个月的长期稳定性检测(t=7)，采用直线为经验模型，假设特性值Y以初始值Y0以一个常数b1线性降解(b1为相对降解速率)，为时间X的函数：Y(b0,b1,X)=Y0(1+b1X)。特性值的不确定度可通过将自变量Y0，X和b1的不确定度传播给因变量Y得到[24,25]。

在没有显著降解的情况下，长期稳定性标准不确定度ults=s(b1)×t=0.136 μg/kg

3.3 日常使用运输与储存条件

从-18 ℃保存的样本看未见微生物腐败、变质情况出现，可保持7个月目标物长期稳定；协同定值是在常温条件下将所制得的鳗鲡样本通过邮政网络传递给8家实验室，从反馈的样品接收状态看，所有实验室均未有诸如胀包、样品变质等不正常样品状态的报告；样品传递后的检测结果也验证了样品中目标物的短期稳定性。综合评估认为所制样品可以常温传递。故该标准物质的保存条件为-18 ℃冷冻密封保存，短期运输条件(≤14 d)为常温运输，运输时间较长时可以采用冰袋冷冻方式。

4 结 论

本研究采用液相色谱-串联质谱法，多家实验室邮政网络协同定值，制得一批含有孔雀石绿代谢物隐性孔雀石绿染料残留的鳗鲡肌肉标准物质。结果量值可靠，均匀性和稳定性良好，孔雀石绿代谢物隐性孔雀石绿特性值为(2.82±0.39) μg/kg(k=2)。本研究建立的研制和定值方法对进一步开展药用染料残留检测用基体标准物质研制具有重要的意义。

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DevelopmentofaReferenceMaterialforLeucomalachiteGreenResiduesinEelMuscle

YIN Taikun1，YANG Fang2，LIU Zhengcai2，LIN Yonghui2

( 1. School of Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China; 2. Technology Centre of Fujian Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China )

Eel (Anguillaanguilla) was bathed in malachite green at certain concentration to make the malachite green enter the eel and contain leucomalachite green (LMG) in muscle via metabolism to establish a method for the preparation and certification of the reference material of leucomalachite green (LMG) residues in the muscle. The positive 500 bags of samples of eel were performed in one batch by the procedure of homogenation, vacuum packing and irradiation. The homogeneity and stability of samples were detected by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The concentration of the chemical constituent of the sample was certified through the collaborative analysis program participated by 8 laboratories, and the uncertainty assessment was performed with property value of 2.82 μg/kg, and the expanded uncertainty of 0.39 μg/kg(k=2). It is concluded that the preparation method for matrix reference materials for the dye residues provides one kind of reference.

eel muscle; leuco malachite green; residue ; reference material

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.014

S912

A

1003-1111(2016)03-0272-06

2015-08-24；

2015-10-08.

质检公益项目(201310143-02);福建省科技重点项目(2012Y6001).

尹太坤(1988-)，男，硕士研究生;研究方向：食品安全分析.E-mail:1257005106@qq.com.通讯作者: 杨方(1969-)，女，主任技师;研究方向：农兽药残留检测.E-mail:yangf@fjciq.gov.cn.