豫北地区主要淡水鱼类感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

贺文旭，毛会丽，杨利敏，符运栋，曾 辉，关建义

( 新乡医学院 生命科学技术学院，河南 新乡 453003 )

豫北地区主要淡水鱼类感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

贺文旭，毛会丽，杨利敏，符运栋，曾 辉，关建义

( 新乡医学院 生命科学技术学院，河南 新乡 453003 )

对豫北地区嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病进行流行病学调查，分离鉴定致病性嗜水气单胞菌菌株，并对致病性嗜水气单胞菌菌株进行毒力验证和药敏试验。采集4个养殖场病鱼标本及水样，每月进行流行病学调查，利用生理生化及分子生物学方法检测嗜水气单胞菌的分布状况。结果显示，筛选出52株为嗜水气单胞菌，其中32株为致病性嗜水气单胞菌，20株为非致病性嗜水气单胞菌，且致病性嗜水气单胞菌主要分布在7—9月份,毒力验证试验表明，32株致病性菌株的毒力大小差异明显，筛选出强毒株XDMG(4)，为后期试验的疫苗株做准备；药敏试验表明，不同菌株对同一种药物的药敏结果不同，但大部分药物的药敏结果基本一致，70%以上的致病性菌株对头孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌药物表现为高度敏感，对青霉素类药物表现为高度耐药性，耐药率达100%，对氨基糖苷类(不包括阿米卡星)、磺胺类、四环素等药物呈现不同程度的耐药性，具有多重耐药性。本试验旨在丰富本地区的鱼类细菌性败血病的病原资料，并为该菌引起的人类疾病的防控提供科学依据。

嗜水气单胞菌；16S rDNA；药敏试验；细菌性败血病

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)广泛存在于自然界中，是一种条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌，其感染淡水鱼类引起爆发性出血病，死亡率极高，主要症状表现为头部、鳍条、腹部等部位充血，严重的眼球突出，在水面上漫游，无食欲，不久即死亡。因此引起了国内外学者对该菌的高度关注[1-3 ]。

检测嗜水气单胞菌多采用传统的生理生化鉴定[4-6]和免疫学方法[7-9]，但因嗜水气单胞菌的诸多生化特征不稳定[10]， 加之其血清型复杂[11]， 采用传统方法鉴定时易发生误判。近年来，众多学者采用分子生物学方法完成病原菌的快速检测[12-16]。为查明嗜水气单胞菌对豫北地区淡水鱼类的危害情况，掌握病害的流行规律、爆发条件以及发病症状等情况，对新乡市新发养殖场、延津东屯粮所渔场、卫辉市东湖养殖场、原阳县黄寺渔场进行了流行病学调查和分析，针对嗜水气单胞菌的16S rDNA和Aer基因设计两对引物，采用双重PCR法检测到若干嗜水气单胞菌，并分析其毒性及耐药性，为掌握嗜水气单胞菌引起的败血症流行性特征和探索更有效的防治方法提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

患细菌性败血病的病鱼，取自河南省豫北地区4个养殖场，取样时间2009年10月至2010年10月。

嗜水气单胞菌J-1标准株，由南京农业大学惠赠。

银鲫(Carassiusauratusgibelio)购自河南卫辉市东湖水产养殖场，选取健康银鲫100尾，每尾质量(30±2) g，体长约14 cm，试验前水族箱中驯养1周，养殖用水为曝气后的自来水，水温(28±1) ℃，试验期间水族箱保持充气，日投饵2次，早晚各1次，换水时间为投饵后3 h，日换水量为40%。证实无病后用于试验。

1.2 主要仪器及试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Markers购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；

16S rDNA上下游引物、Aer上下游引物购自上海生物工程有限公司；糖发酵试剂盒、氧化酶试剂盒、药敏纸片购自杭州天和微生物制剂有限公司，其他试剂均为国产分析纯。配制LB营养肉汤、LB琼脂平板、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板、灭菌碱性蛋白胨水、草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、复红酒精染液。

1.3 方法

1.3.1 细菌性败血病流行性调查

2009年10月—2010年10月，分别在新乡市新发养殖场、延津县东屯粮所渔场、卫辉市东湖养殖场、原阳县黄寺渔场进行细菌性败血病流行病学调查。填写水产动物流行病学调查表(表1)。

表1 流行病调查

注：1.命名规则：新乡填X，样本采样次数①②③④⑤，水样(W)，鱼种(鲫鱼J、鲤鱼Li、鲢鱼L、草鱼C、麦穗鱼M)，器官(肝 G 脾 P 肾 Sh 鳃 S).2.新发养殖场鱼塘来源填A， 延津东屯粮所渔场来源填B，卫辉市东湖渔场来源填D，原阳黄寺渔场来源填E.粗体标示的为致病性菌株，其他为非致病性菌株.

1.3.2 嗜水气单胞菌的分离

1.3.2.1 病原菌的分离

按照常规方法，无菌条件下对试验鱼体进行病原菌的分离：先将试验鱼消毒后，自试验鱼肝、肾、脾、鳃部等部位分离病原菌，将其研磨并涂布接种于LB固体培养基平板，28 ℃培养24 h，使之形成单个菌落，观察菌落形态特征，挑取优势菌株，划线纯化后，接种于LB固体培养基培养，4 ℃保藏。

1.3.2.2 水样的分离

用孔径为0.22 μm的硝酸纤维素微孔滤膜过滤水样(细菌阻隔在滤膜上)。取出滤膜，置含有灭菌碱性蛋白胨水的试管中，28 ℃培养24 h，划线接种于LB平板。28 ℃培养24 h。

1.3.3 致病性嗜水气单胞菌的鉴定

1.3.3.1 菌落形态观察

嗜水气单胞菌在普通琼脂平板上28 ℃培养24 h后的菌落为光滑、微凹、圆整、无色或淡黄色，有特殊芳香气味。

1.3.3.2 生化鉴定

参照致病性嗜水气单胞菌生理生化鉴定方法的国家标准，分别进行氧化酶试验、致病性嗜水气单胞菌鉴别培养、革兰氏染色、吲哚试验、糖发酵试验、脱脂奶平板试验。

1.3.3.3 嗜水气单胞菌的16S rDNA扩增和Aer基因检测

无菌操作沾取常见生化指标阳性的培养物于10 mL LB液体培养基中。28 ℃，200 r/min震荡培养10～12 h。参照说明书，用试剂盒提取嗜水气单胞菌的基因组，-20 ℃保存。根据已发表的16S rDNA、Aer序列和文献设计并合成引物。引物序列见表2。

多重PCR扩增体系(25 μL)：2×Taq plus PCR Master Mix 12.5 μL，16S rDNA上下游各1 μL，Aer上下游引物各1 μL。然后加入制备好的PCR模板1.0 μL，最后加入超纯水补足至25 μL即可。设阴性对照 (以无菌双蒸水代替DNA模板)和阳性对照(J-1标准株为模板)。94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。取8 μL产物，点样于 1.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，120 V电压，电泳20 min，于凝胶成系统下拍照判定，只16S rDNA特异条带(685 bp)判定为嗜水气单胞菌，与Aer基因(301 bp)同有的判定为致病性嗜水气单胞菌。

表2 16S rDNA与4种毒力基因PCR扩增引物序列

1.3.4 致病性菌株的半致死密度的测定及回归检测

取上述鉴定为致病性嗜水气单胞菌的32株代表株分别接种于营养肉汤28 ℃摇床培养16 h。培养物利用血小球计数板计数，每株菌的试验组分5组，每组10尾鱼，将菌液以10-1、10-2、10-3、10-4倍比稀释，每个稀释度菌液对银鲫进行腹腔注射，每尾注射0.2 mL,同时设生理盐水对照。试验鱼蓄养于已消过毒的水族箱里，自来水已曝气24 h，充气，水温控制在28 ℃，定期清污换水、投喂食物。每日记录每组鱼的死亡情况，参考Reed-Muench法计算半数致死密度，半数致死密度越低的菌株毒性越强。同时对濒死病鱼进行病原菌分离鉴定。

1.3.5 药敏试验

采用纸片扩散法，取100 μL菌悬液(经显微镜计数约109cfu/mL)涂布于LB平板，用无菌镊子将30种不同的抗生素纸片轻轻贴在平板表面，28 ℃恒温培养48 h后测定抑菌圈直径。根据抑菌圈直径的大小，以及抗生素纸片产品的说明，判定该菌株对抗生素的敏感性。

1.3.6 菌种保藏

无菌操作挑取所保留斜面培养基上的菌种1～2环接种于10 mL LB营养肉汤培养基，28 ℃，培养12 h；将12 h培养液按1∶100比例转接于10 mL营养肉汤培养基中，28 ℃再培养7 h。在超净工作台内操作，将最终的培养液与20%的灭菌脱脂奶稀释液按1∶1比例混合。将菌种和保护介质混合液分装至灭菌的冷冻干燥管，分装量以到达冷冻干燥管1/2为宜，冰箱-20 ℃预冷冻2 h，然后置于冰箱-70 ℃冷冻10 h，真空冷冻干燥后将干燥好的菌种置于-70 ℃低温保藏。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查结果与分析

通过对豫北地区4个养殖场实地调查，仅延津东屯粮所渔场鱼塘在鱼体未检测到致病性嗜水气单胞菌，只在水体中检测到非致病性的嗜水气单胞菌。其他3个在鱼体中均检测到致病性嗜水气单胞菌，其比例分别为：新发养殖场渔场12.5%、卫辉市东湖渔场71.9%和原阳黄寺渔场15.6%。其中卫辉市东湖渔场最高。

嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病具有明显的季节性，流行时间为6-10月，5月开始出现少量的感染，6—9月为感染的爆发期，整个养殖场水面出现大片的死鱼，10月后开始减少，同时检测水体的温度也发现，水温持续25 ℃或者持续28 ℃以上感染最为严重，但有时水温在20 ℃以下，也检测到嗜水气单胞菌但均为非致病性的。说明该病与季节温度变化的关系密切相关。其次，养殖场感染的鱼类主要为鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、鲫鱼(Carassiusauratus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、麦穗鱼(Pseudorasboraparva)和鲤鱼(Cyprinuscarpio)等，致病性嗜水气单胞菌在这些鱼中的分离率分别为43.8%、28.1%、12.5%、12.5%和3.1%。患病鱼游动缓慢，基本不摄食；离群独游于水面上；体表均有充血、出血现象，鳃丝出血明显，不同程度脱鳞，剖检时可见鳃部有小鞘指环虫(Dactylogyrusvaginulatus)、显著车轮虫(Trichodinanobillis)、大中华鳋(Sinergasilusmajor)等寄生虫感染；肝脏、脾脏、肾脏不同程度肿大出血；肠道不同程度积水，肠内无或有少量食物，表现为典型败血症感染症的特征。

根据调查表的数据显示，4个养殖场的水质pH值波动不大，氨氮和亚硝酸盐含量变化较大，在养殖初期不明显，随着温度的上升，鱼摄食量增加，自然导致投喂饲料量及其排泄量增加，其氨氮和亚硝酸盐含量随之增大、水体呈低溶解氧状态，再加上其养殖模式为精养高产模式，从而导致鱼体抗病力下降也是导致细菌性败血病爆发的原因。

2.2 分离菌的鉴定

2.2.1 形态特征

所得菌株的形态一致，均为革兰氏染色阴性、两端钝圆、散在或个别成双排列、无芽孢、大小多在0.4～0.8 μm ×1.0～2.2 μm的杆菌。

2.2.2 理化性状

生化鉴定结果为氧化酶试验阳性、致病性嗜水气单胞菌鉴别培养阳性、革兰氏染色阴性、吲哚试验阳性、糖发酵试验阳性。从而初步筛选出107株菌株。

2.3 16S rDNA和Aer基因的PCR扩增结果

通过对16S rDNA和Aer基因的双重PCR扩增，判定无任何条带出现的55株菌株不是嗜水气单胞菌，只在16S rDNA片段处有条带的是嗜水气单胞菌，共20株；而在16S rDNA和Aer片段处均能出现条带的为致病性嗜水气单胞菌，共32株。因此判定共有52株是嗜水气单胞菌。其部分扩增结果见图1。

图1 部分嗜水气单胞菌16s rDNA、Aer基因PCR扩增产物电泳图谱

注：编号1～30为临床分离株；编号31、32为阴性对照菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；编号33为空白对照，以无菌双蒸水代替模板；编号34为阳性对照菌：嗜水气单胞菌J-1标准株.

2.4 致病性菌株的半致死密度的测定及回归检测结果

由表1可见，在32株致病菌株的半致死密度存在一定的差别，其值越小则毒性越强。其中菌株XDMG(4)最小(1.13×105cfu/mL)，说明该菌株毒力最强，可作为后期研究的备用疫苗株。

发病并死亡的试验鱼胸鳍、腹鳍、臀鳍的基部及肛门充血，与自然发生的爆发性出血病症状一致。剖检肝脏进行菌株的分离、培养，得到大量纯一的同种菌株，通过对其进行形态观察，生理生化特征及16S rDNA基因序列等指标的测定，结果与原感染菌株完全一致。

2.5 药敏结果

分离的52株嗜水气单胞菌对30种药物的药敏结果显示：不同菌株对同一种药物的药敏结果不同，有的甚至差别很大，但大部分药物的药敏结果基本一致。70%以上的菌株对头孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌药物表现为高度敏感，对青霉素类药物表现为高度耐药性，耐药率达到100%，对氨基糖苷类(除去阿米卡星)、磺胺类、四环素等药物呈现不同程度的耐药性，具有多重耐药性。这一结果，可以为本地区养殖业提供用药依据，但其药物的剂量、效果还待进一步研究。

3 讨 论

3.1 豫北地区嗜水气单胞菌爆发流行原因

通过流行病学调查发现，引起豫北地区细菌性败血病的病原体主要是致病性嗜水气单胞菌，发病的病因与6—9月的高温季节、养殖密度过高、水体环境恶化、寄生虫衍生繁殖、嗜水气单胞菌大量滋生等一系列因素息息相关，造成了该病的爆发。这与司丽娜等[17]的研究结果相同。

延津东屯粮所渔场鱼塘未在鱼体内检测到致病性嗜水气单胞菌，也未见爆发性出血病发生，只在水体中检测到非致病性的嗜水气单胞菌。这与该渔场池塘面积小、定期进行杀虫、清塘消毒杀菌、科学预防有关。卫辉市东湖渔场在4个渔场中检测到致病性嗜水气单胞菌比例是最高的(71.9%)，主要养殖鱼类均感染，且死亡率高，这可能与该鱼塘面积较大(0.15 hm2)定期进行杀虫、消毒不便有关，且在病鱼鳃部也检测到大量中华鳋、指环虫等寄生虫，从而引起嗜水气单胞菌感染。

3.2 豫北地区嗜水气单胞菌的鉴定及耐药性

通过生理生化和分子生物学检测快速检测得到32株致病性嗜水气单胞菌，且对32株进行毒性试验和药敏试验，证明其致病性和耐药性存在差异。发现32株致病性嗜水气单胞菌均能使试验鱼爆发与自然发病鱼一致的症状，但死亡率不同，特别是菌株XDMG(4)，毒力(半致死密度1.13×105cfu/mL)明显强于其他菌株，后续工作将继续研究其致病性，为后期基因疫苗的筛选做准备；药敏试验结果证明嗜水气单胞菌的耐药情况十分严重，这与各养殖厂滥用、乱用药物有关，也与耐药菌株在各个养殖场的互相流通有关。这就要求在实际生产实践中科学地合理地使用嗜水气单胞菌敏感的药物，如头孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等，并经常轮换，预防耐药菌株的产生[18-19]。

3.3 豫北地区嗜水气单胞菌的防治

在鱼类的养殖过程中要坚持以预防为主、防治结合的策略，以减少该病的发生。首先，要做好养殖场的清淤消毒工作，保证鱼塘的水质优良；其次，及时杀虫、杀菌是防治工作的重中之重，因为寄生虫的大量繁殖定会造成鱼类的鳃部、体表等受伤，伤口又为细菌感染创造了条件，而嗜水气单胞菌是条件性致病菌，就会趁机造成该病的爆发；最后，当鱼体出现该病时要合理用药，减少抗生素的应用，且积极研制本地区的基因工程疫苗，才能有效的防治该病的发生。总之，本试验对把握豫北地区嗜水气单胞菌的流行病学特征具有重要意义，为制备适合本地区疫苗提供了前期基础。

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EpidemiologicalInvestigationofAeromonashydrophilaInfectionIsolatedinMajorFresh-waterFishesfromNorthernRegionsinHenan,China

HE Wenxu，MAO Huili, YANG Limin, FU Yundong, ZENG Hui, GUAN Jianyi

( School of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003， China )

To investigate the epidemiology of bacterial septicemia outbreak in fish,Aeromonashydrophilawere isolated and identified from the northern regions of Henan Province, China, and the virulence and drug sensitive characteristics of pathogenic strains were verified. The diseased fish samples and water samples were collected from 4 fish cultured area in the northern regions of Henan Province. Epidemiological investigation were performed once a month, and the distribution ofA.hydrophilawere detected by physiological and biochemical and molecular biological methods. A total of 52A.hydrophilastrains, 32 pathogenic strains, 20 non pathogenic strains, were isolated and the pathogenic strains were primary distributed from July to September. Virulence experiment showed that there were different toxicities among 32 pathogenic strains, through which the highest virulent strain XDMG(4) were screened, which will be as the vaccine strain for further experiments. Drug resistance indicated that differenct sensitivity to the same drug varried with different strains, but most drug resistance was consistent. About 70% pathogenic strains were highly sensitive to Cefoperazone，Florfenicol，Ceftriaxone Sodium and Amikacin, highly resistant to penicillin drugs，with resistance rate of 100%, and certain extent resistance to Aminoglycosides(except Amikacin), Sulfonamides, and Tetracycline. The different strains showed differences in drug resistance. The findings would help enrich in epidemic data of the bacteria septicemia in this region, and provide scientific theoretical basis for human disease caused byA.hydrophila.

Aeromonashydrophila; 16S rDNA; drug sensitive test; bacterial septicemia

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.015

S917

A

1003-1111(2016)03--0278-06

2015-08-27；

2015-11-10.

国家自然科学基金资助项目(30940008)；2013年国家大学生创新课题(201310472007)；河南省科技厅科技攻关项目(132102310165)；河南省教育厅科技攻关项目(2011A240001).

贺文旭(1993-)女，在校本科生；研究方向：病原微生物.E-mail:mhlfff@126.com. 通讯作者： 关建义(1969-)男，副教授，硕士；研究方向:病原微生物.E-mail:jianyiguan@163.com.