胡椒总多酚的提取及其抗氧化活性研究

吴桂苹，黄菲菲，李恒，谷风林，朱红英

（1中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南万宁571533；2国家重要热带作物工程技术研究中心，海南万宁571533；3农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室，海南万宁571533；4华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

胡椒总多酚的提取及其抗氧化活性研究

吴桂苹1,2,3，黄菲菲1,4，李恒1,2,3，谷风林1,2,3，朱红英1,2,3

（1中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南万宁571533；2国家重要热带作物工程技术研究中心，海南万宁571533；3农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室，海南万宁571533；4华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

明确总多酚在胡椒果上的分布与抗氧化活性，建立胡椒总多酚的提取和分析方法，为胡椒总多酚的进一步研究奠定基础。以黑胡椒果实为主要原料，通过单因素和正交实验，分析乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度等4个因素对胡椒总多酚提取率的影响。以没食子酸作为标准物质，利用福林酚比色法测定黑胡椒提取液中总多酚含量。分析测定胡椒果皮、种子和果梗中总多酚含量。以维生素C作对比，清除DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)作为评价抗氧化活性指标，分析总多酚含量与IC50的相关性。结果表明：胡椒总多酚的最佳提取条件为55%乙醇浓度、提取时间4 h、料液比1:30(g/mL)、提取温度90℃，黑胡椒总多酚含量为6.556 mg/g。总多酚类物质在胡椒果梗中含量最高，为12.208 mg/g，其次为果皮(12.105 mg/g)，种子最低(2.891 mg/g)。胡椒总多酚含量与IC50值呈显著负相关(P＜0.05)。胡椒总多酚相对维生素C具有更高的清除DPPH自由基能力。总多酚是胡椒的重要抗氧化活性成分，胡椒果梗和果皮可以作为一种良好的天然抗氧化剂物质来源。

胡椒；总多酚；提取；抗氧化活性；DPPH

0 引言

胡椒(Piper nigrum L.)，胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)多年生常绿藤本植物，原产于印度，是世界重要的热带香辛料作物，亦是人们喜爱的调味品，在医学工业和食品工业都有广泛用途。中国胡椒种植面积超过3万hm2，年总产量超过3万t，面积和产量分别居世界的第6位和第5位。海南省是中国胡椒的主产区，种植面积和产量均占全国的90%以上[1]。在国际贸易上以黑胡椒产品为主，而中国以白胡椒产品为主，因其耐贮藏，相对黑胡椒不易受微生物污染[2]，且在烹调过程中不影响色泽，因此深受海南人民的喜爱。但黑胡椒的抗氧化活性显著高于白胡椒产品[3]，这与胡椒果皮的存在和胡椒果实的加工工艺密切相关，胡椒果皮中存在多酚类物质[4]。近年来，国内外对植物中的多酚类物质的提取、测定及其抗氧化活性有大量的研究报道[5-10]，多以乙醇为提取溶剂，福林酚比色法测定总多酚含量[11-12]，以清除DPPH自由基的能力来评价抗氧化活性。但胡椒总多酚的研究相对较少，国外主要集中在体外抗氧化活性的研究[13-15]，国内，张水平等[3]研究报道了胡椒叶中总多酚含量及其抗氧化活性高于胡椒果，但没有用IC50来评价其抗氧化活性，吴桂苹等[16]研究报道了不同成熟度胡椒果实中总多酚含量，其提取和分析测定方法均参考国家标准GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》的方法提取和检测。杨继敏等[17]研究报道了热风干燥、冷冻干燥所得果梗中总多酚含量，但未对其抗氧化活性进行评价。由于研究作物不同，使用同一提取、分析方法必然会增大其物质含量的不确定度。目前，尚未见胡椒多酚类物质提取优化的研究报道。因此，在前人的研究基础上，采用不同浓度的乙醇作为提取溶剂，对海南黑胡椒果实中总多酚进行提取优化和含量测定，并对胡椒果皮、种子和果梗中的多酚类物质进行分析测定。研究了不同浓度提取物清除DPPH自由基的生物活性，通过IC50，并与维生素C作为对比，评价其抗氧化活性。旨在确定胡椒总多酚类物质的最佳提取工艺条件，明确胡椒总多酚在胡椒果皮、种子以及果梗中的含量分布情况，为进一步研究胡椒总多酚的组成奠定基础，同时为合理开发利用胡椒初加工中的废弃物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料试验用印尼大叶种胡椒由海南省万宁市兴隆热带植物园提供，采收当天挑选果型完好、无病虫害和机械损伤的果穗，果实色泽一致，均为绿色，摊放在清洁的地面上日晒干燥至水分含量＜12%。同时用真空冷冻干燥机对胡椒鲜果进行冷冻干燥，干燥后用密封袋密封于-40℃冰箱保存，待测。

实验于2015年8月—2016年5月在中国热带农业科学院香料饮料研究所综合实验楼完成。

1.1.2 试剂无水乙醇（分析纯），碳酸钠（分析纯），没食子酸（色谱纯，纯度≥98%），福林酚试剂（Sigam公司），维生素C（色谱纯，纯度≥98%），DPPH（Sigam公司）。1.1.3设备QE-300 g高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；MS3 basic漩涡混合器（广州IKA科技有限公司）；Z36HK全能台式高速冷冻离心机（德国Hermle公司）；JDG-0.2真空冷冻干燥机（兰州科近真空冻干技术有限公司）；U1700紫外-可见光分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）；DK-8D恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

（1）提取溶剂浓度。设定料液比为1:20(g/mL)、提取时间为1.0 h，提取温度为60℃，分别用15%、35%、55%、75%、95%的乙醇水溶液提取。

（2）提取温度。设定乙醇浓度为55%、料液比为1:20(g/mL)、提取时间为1.0 h，分别于40、50、60、70、80、90、100℃提取胡椒总多酚。

（3）提取时间。设定乙醇浓度为55%、提取温度为60℃、料液比为1:20(g/mL)，提取时间分别为1.0、2.0、3.0、4.0 h。

（4）料液比。设定乙醇浓度为55%、提取时间为1.0 h、提取温度为60℃，料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)。

以上均平行3次，提取中均使用带螺旋盖的离心管，防止提取过程爆沸和溶剂损失。提取结束后于25℃8000 r/min离心15 min，收集上清液，并定容至25 mL棕色容量瓶中，测定总多酚含量。

1.2.2 试验结果分析根据单因素试验与分析结果，选择4因素3水平构建正交设计表。

1.2.3 总多酚含量测定参考江丽芳[18]的方法测定，略有修改。即0.5 mL胡椒提取物加入到25 mL棕色容量瓶中，然后加入2 mL 10%福林酚试剂，混匀后加入3 mL 10%Na2CO3溶液，充分混合，用超纯水定容至25 mL容量瓶中。室温下避光反应40 min，测定其溶液在760 nm处的吸光值。总多酚的含量表示为每克胡椒样品中含有的没食子酸当量毫克数(mgGAE/g)。重复3次测定。标准曲线为y=0.1625x+0.0566，R2=0.9963。总多酚含量的计算见公式(1)：

总多酚含量(mg/g)=(C×25×50)/(1000×W)……(1)

其中C为待测液在容量瓶中的总多酚含量(μg/g)，25为测定时定容的体积(mL)，50为提取液最终折算的稀释倍数，W为样品质量(g)。

总多酚含量亦为提取量，即从胡椒样品中提取总多酚的含量，单位同上。

1.2.4 清除DPPH自由基能力的测定参考Suchandra等[14]的方法测定，略有修改。先将胡椒多酚提取物用55%乙醇配制成不同浓度的待测液，再将2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液加入到1.0 mL胡椒提取液中，充分混合，室温下在暗处静置30 min。以无水乙醇调零，用2 mL 0.2 mmol/L DPPH和1 mL无水乙醇溶液作为溶剂空白，同时做样品空白，即用无水乙醇代替0.2 mmol/L DPPH，其余同样品测定，30 min后测定517 nm处的吸光值。每个样品平行测定3次，取平均值计算样品对DPPH自由基的清除率，见计算公式(2)。

DPPH清除率=[1-(A样品-A样品空白)/A溶剂空白]×100%………………………………………………………(2)

依据公式计算得到的清除率，用SPSS 17.0软件计算得到样品的IC50值，即DPPH自由基清除率为50%时所需样品的浓度。

1.3 数据分析

试验数据用Excel和SPSS 17.0统计分析软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对胡椒总多酚提取效果的影响

乙醇浓度对胡椒总多酚提取效果的影响结果如图1所示。结果表明，随着乙醇浓度的升高，总多酚含量呈上升的变化规律，当乙醇浓度达到55%时，总多酚含量最高，当乙醇浓度继续增加，总多酚含量在逐渐降低，因此，选择55%乙醇为提取溶剂。

图1 乙醇浓度对胡椒总多酚提取的影响

2.2 浸提时间对胡椒总多酚提取效果的影响

图2 提取时间对胡椒总多酚提取的影响

提取时间对胡椒总多酚提取效果的影响结果如图2所示。结果表明，随着提取时间的升高，胡椒总多酚的含量呈上升的变化规律，但当提取3 h后，总多酚含量下降，这与多酚类化合物的性质有关，在一定温度条件下多酚类化合物容易分解，因此，选择提取3 h为宜。

2.3 料液比对胡椒总多酚提取效果的影响

料液比对胡椒总多酚提取效果的影响结果如图3所示。结果表明，随着料液比的增加，胡椒总多酚的含量呈上升的变化规律，但当料液比增加到1:25后，总多酚含量有所下降。溶剂量的增加，在一定程度上有利于目标化合物的溶出，但同时也会使其他物质溶出。因此，选择料液比为1:20、1:25、1:30作为正交实验中料液比的3个水平。

2.4 提取温度对胡椒总多酚提取效果的影响

提取温度对胡椒总多酚提取效果的影响结果如图4所示。结果表明，随着提取温度的升高，胡椒总多酚含量逐渐增加。在70～90℃，总多酚提取量增长较快，提取温度为90℃时总多酚含量最高，当温度上升到100℃时，总多酚含量减少，而提取温度为80、100℃时，其总多酚含量无显著性差异，且在实际提取过程中，100℃高温易使提取溶剂沸腾，致使溶剂损失，因此选择70、80、90℃作为正交实验中提取温度的3个水平。

图3 料液比对胡椒总多酚提取效果的影响结果

图4 提取温度对胡椒总多酚提取效果的影响结果

2.5 正交实验结果

在单因素实验基础上，采用L9(43)正交试验设计进行乙醇浓度、提取时间、料液比和提取温度的正交实验，结果如表1所示。

表1 胡椒总多酚提取正交实验设计与结果

表1极差分析显示，影响胡椒总多酚提取效果的因素依次为提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比，综合实验结果得出胡椒总多酚的最佳提取工艺组合为A2B3C3D3，即乙醇浓度为55%、提取时间4 h、料液比1:30(g/mL)、提取温度90℃。

从表2的方差分析结果可知，影响因素中可以看出各个因素对胡椒总多酚得率均有显著的影响，其主次关系是：料液比＞提取时间＞乙醇浓度＞提取温度。同时通过计算边际估算均值，结果如表3所示，得到最佳组合为A2B3C3D3，这与正交实验优化出的最佳工艺相符。

在最佳工艺条件下进行6次平行实验，胡椒总多酚含量平均值为(6.556±0.022)mg/g。

2.6 胡椒总多酚提取物的抗氧化活性评价

由于抗氧化剂浓度较高时，其浓度与DPPH自由基清除率不呈线性关系，仅通过比较清除率大小不能很好地表示抗氧化剂的活性，更不能比较不同抗氧化剂的活性，因此，选用IC50值作为抗氧化剂清除自由基能力的测定指标。IC50值越小，其清除DPPH自由基的能力越强[19]。将最佳工艺提取出的黑胡椒果实中总多酚提取物用55%乙醇配制成等不同浓度的待测液，测定其DPPH自由基的清除率，以DPPH清除率为纵坐标，提取液浓度为横坐标作图，见图5。

续表1

实验号A.乙醇浓度/%B.提取时间/hC.料液比/(g/mL)D.提取温度/℃总多酚提取量，没食子酸当量/(mg/g) k2 k3 R 5.943 5.654 0.553 5.616 5.947 0.524 5.497 5.980 0.483 5.470 6.250 0.984

表2 方差分析与显著性检验

表3 因素水平对胡椒总多酚提取的影响

从图5可以看出，胡椒总多酚对DPPH自由基的清除率在15%～70%范围内，清除率与浓度呈良好的线性关系。通过SPSS软件计算其IC50为0.059 μg/mL。

胡椒果实为穗状花序（如图6所示），果粒只有在完全成熟时才从果穗上自然脱落，在实际生产中常在胡椒果实完全成熟前15～30天采收。因此，为充分明确胡椒果实中总多酚的大概含量分布情况，将整串胡椒鲜果冷冻干燥后，分别对胡椒果皮、种子、果梗进行总多酚类物质的提取，测定其DPPH自由基清除率，并通过SPSS软件计算IC50，结果如图7～9所示。同时比较了维生素C对DPPH自由基的清除率，结果如图10所示。

图5 黑胡椒果实总多酚提取液与DPPH自由基清除率的线性关系

图6 胡椒鲜果

从图11可以看出，维生素C的IC50值远远高于胡椒提取物，约是其值的100倍。而IC50值越小，其清除DPPH自由基的能力越强[19]。这说明，胡椒提取物清除DPPH自由基的能力显著高于维生素C。胡椒不同部位的提取物对DPPH自由基清除率大小依次为：胡椒果梗＞胡椒果皮＞黑胡椒果实＞胡椒种子。

2.7 胡椒总多酚含量与IC50值得相关性分析

经Pearson检验，胡椒总多酚提取物的IC50值与其总多酚含量之间有显著的负相关性(P＜0.05)，Pearson相关系数为-0.942。这说明胡椒总多酚提取物是使胡椒具有强抗氧化活性的物质基础。

3 讨论与结论

本试验确定了胡椒中总多酚类物质的最佳提取方法，在此条件下胡椒总多酚提取量可达到(6.556± 0.022)mg/g。其结果相对张水平等[3]的研究报道略高，其黑胡椒果实中总多酚含量为6.0 mgGAE/(g·DW)，这可能与提取溶剂和方法有关，吴建华等[20]采用分级提取法，先用水提取，再用丙酮提取，提取过程中可能存在多酚类物质的损失。在提取溶剂选择方面，多选用乙醇作为溶剂提取多酚类物质。而不同植物总多酚的分布及结合方式的不同，必然会造成提取条件和结果的差异。如林建城等[21]研究了枇杷果皮多酚的最佳提取工艺，在浸提温度为80℃，乙醇体积分数为50%，料液比为1:10(g:mL)，浸提时间90 min，连续浸提2次，多酚得率可达34.76 mg/g.DW，张素斌等[22]研究了田基黄多酚的提取，结果表明，料液比为1:30、乙醇浓度30%、60℃提取30 min，田基黄多酚含量可达到2.8%。国外，Aftab等[15]采用索氏抽提法胡椒果实进行指纹图谱研究，经过甲醇回流提取6 h，其总多酚含量为1.728 mg/g，远低于本试验中黑胡椒果实中总多酚的含量，这可能不仅与提取方式和条件有关，还与胡椒品种、种植区域等密切相关。在本研究的单因素试验中，发现不同水平下的胡椒总多酚提取量存在显著性差异，特别是在溶剂浓度的选择上，使用55%乙醇提取的胡椒总多酚提取量是95%乙醇提取量的2倍以上，而在40～100℃不同温度范围内，胡椒总多酚提取量从3.430 mg/g逐渐增加到5.589 mg/g再下降到5.122 mg/g。温度越高，提取量相对越大，本试验中均采用带螺旋盖离心管提取，提取过程中尽量避光，减少了提取过程中客观因素的影响。但温度太高如100℃易使溶剂沸腾，对容器会造成不同程度的影响，进而影响了提取量和试验的可重复性，且总多酚在高温下亦会发生化学反应，这也是大多数植物采用70℃左右温度提取的原因。经过正交试验优化，各因素间存在交互作用，并进一步验证，胡椒总多酚提取量可达到(6.556±0.022)mg/g，但其物质组成及化学结构仍需深入研究。

图7 胡椒果皮总多酚提取液与DPPH自由基清除率的线性关系

图8 胡椒种子总多酚提取液与DPPH自由基清除率的线性关系

图9 胡椒果梗总多酚提取液与DPPH自由基清除率的线性关系

图10 维生素C与DPPH自由基清除率的线性关系

图11 维生素C和胡椒总多酚提取物对DPPH自由基的清除能力

海南98%以上种植的胡椒加工为白胡椒产品，但白胡椒在加工过程中果皮和果梗往往废弃，不仅污染环境，而且劳动强度大。因此，本试验对采收后的整穗胡椒进行真空冷冻干燥，使其水分含量降至10%以下，再通过手工分离，对胡椒果皮、种子和果梗中总多酚进行提取分析，发现总多酚在胡椒果梗中含量最高，为12.208 mg/g，其次为果皮(12.105 mg/g)，种子最低(2.891 mg/g)，而果梗和果皮约占胡椒果穗的1/4以上。葛畅等[4]亦通过重氮化、盐酸-镁粉实验证明了胡椒鲜果果皮中酚类、黄酮类物质的存在，但含量多少尚未分析确定。同时，对胡椒提取物清除DPPH自由基的能力进行了评价，以IC50值作为评价指标，并与维生素C作为对比。研究发现，胡椒果梗、果皮、种子以及黑胡椒果实的总多酚提取物的抗氧化能力均显著强于维生素C。在后期的研究工作中，将对胡椒总多酚的具体物质组成及其结构进一步研究鉴定。本试验的研究结果不仅说明了胡椒总多酚提取物是使胡椒具有强抗氧化活性的物质基础，而且在一定程度上表明了黑胡椒色泽的形成与其果皮中多酚类物质的氧化密切相关，其氧化后仍具有较强的抗氧化活性。这些废弃的原料如能充分加以利用，开发出具有强抗氧化活性的产品，可提高胡椒产品的附加值，扩大胡椒资源的综合利用率，极大推进胡椒产业的可持续发展。

试验研究结果表明，胡椒总多酚的最佳提取条件为：提取溶剂为55%的乙醇水溶液、提取时间4 h、料液比为1:30、提取温度90℃，黑胡椒中总多酚的含量为6.556 mg/g，鲜果果皮、种子、果梗中总多酚的含量分别为12.105、2.891、12.208 mg/g。黑胡椒总多酚提取物及果皮、种子、果梗总多酚提取物清除DPPH自由基的IC50值分别为0.059、0.039、0.121、0.0226 μg/mL，其抗氧化活性远远高于维生素C。经Pearson检验，胡椒总多酚提取物的IC50值与总多酚含量存在显著的负相关性(P＜0.05)，Pearson相关系数为-0.942。胡椒总多酚是胡椒抗氧化活性的重要组成成分之一，胡椒果梗和果皮可以作为一种良好的天然抗氧化剂物质来源。

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Extraction and Antioxidant Activity of Total Polyphenol from Black Pepper(Piper nigrum L.)

Wu Guiping1,2,3,Huang Feifei1,4,Li Heng1,2,3,GuFenglin1,2,3,Zhu Hongying1,2,3
(1Spice and Beverage Research Institute,CATAS,Wanning 571533,Hainan,China；2National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research,Wanning 571533,Hainan,China；3Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops,Ministry of Agriculture,Wanning 571533,Hainan, China；4College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,Hubei,China)

The extraction and analysis method of total polyphenol from black pepper(Piper nigrum L.)was established to explore the distribution in black pepper fruit and antioxidant activity of total polyphenol,which would contribute to further study on total polyphenol in black pepper.Taking black pepper fruit as the main raw material,through single factor and orthogonal experiments,the influence of ethanol concentration, extraction time,solid-liquid ratio,extraction temperature on pepper total polyphenol extraction yield was analyzed.The total polyphenol content in extract of black pepper was analyzed using Folin-Ciocalteu colorimetry with gallic acid as standard.The total polyphenol content in pepper peel,seed and stem was alsomeasured.The antioxidant potential of the total polyphenol extract from black pepper was evaluated for their ability to scavenge 1,1’-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)free radical,and half maximal inhibitory concentration(IC50)was calculated as antioxidant activity evaluation index.The results showed that the optimal condition for total polyphenol extraction was ethanol of 55%,solid-liquid ratio of 1:30(g/mL),temperature of 90℃and time of 4 h,respectively.The total polyphenol content in black pepper was 6.556 mg/g.The highest content of total polyphenol(12.208 mg/g)was detected in black pepper stem,followed by peel(12.105 mg/g), while the lowest was in seed(2.891 mg/g).The total polyphenol content in black pepper was significantly and negatively correlated with IC50value(P＜0.05).Compared with vitamin C,the total polyphenol extract from black pepper had more powerful free radical scavenging capacity.Total polyphenol might be the main component contributing to antioxidant activity of pepper.Peel and stem of black pepper could be used as good source of natural antioxidant.

Black Pepper；Total Polyphenol；Extraction；Antioxidant Activity；DPPH

TS201.2

A论文编号：cjas16070007

国家基金委国家自然科学基金面上项目“黑胡椒制备中褐变与风味品质形成机理研究”(31471674)。

吴桂苹，女，1981年出生，湖北松滋人，助理研究员，硕士，研究方向为农产品加工与食品化学。学术成就：发表论文6篇，获得发明专利2项，实用新型专利3项。通信地址：571533海南省万宁市兴隆华侨农场兴隆热带植物园中国热带农业科学院香料饮料研究所，Tel：0898-62556090，E-mail：guiping81@163.com。

朱红英，女，1973年出生，海南儋州人，副研究员，本科，研究方向为农产品加工与食品机械。学术成就：发表论文3篇，获得发明专利2项，实用新型专利5项。通信地址：571533海南省万宁市兴隆华侨农场兴隆热带植物园中国热带农业科学院香料饮料研究所，Tel：0898-62556090，E-mail：zhhy-2004@163.com。

2016-07-08，

2016-09-18。