乳糖乳杆菌的培养条件优化研究

2016-12-20马燕谢式云易永红金桩陈俊波

养猪 2016年5期

关键词：静置乳糖菌液

马燕，谢式云，易永红，金桩，陈俊波

（1.罗牛山股份有限公司，海南海口570125；2.海南罗牛山畜牧有限公司，海南海口570100；3.海南职业技术学院，海南海口570126）

乳糖乳杆菌的培养条件优化研究

马燕1，谢式云1，易永红1，金桩2，陈俊波3

（1.罗牛山股份有限公司，海南海口570125；2.海南罗牛山畜牧有限公司，海南海口570100；3.海南职业技术学院，海南海口570126）

研究通过单因子优化和正交试验对乳糖乳杆菌培养条件进行初步的优化。结果表明，乳糖乳杆菌属于厌氧菌，在改良MRS培养基中培养最佳条件是：温度为35℃，培养时间为48 h，初始pH为9.0，接种量为2.0%；乳糖乳杆菌最适合生长培养基成分为蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g，乙酸钠5 g，柠檬酸铵2.15 g，Tween 80 1 mL，七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g，四水硫酸锰（MnSO4·4H2O）0.05 g，磷酸氢二钾（K2HPO4）2 g，琼脂粉17 g，水1 000 mL。此时OD值能达到1.638，活菌数能达到1.88×109cfu/mL。

乳糖乳杆菌；培养条件；培养基成分；优化；OD值；活菌数

从20世纪60年代开始人们发现在动物饲养业中使用抗生素的种种弊端。由于在饲料中抗生素的广泛应用，导致动物胃肠道正常菌群失调，产生耐药性和药物残留等副作用，给动物和作为动物产品消费者的人类健康都带来了危害[1-2]。于是人们关注和寻找能够克服上述弊端的抗生素替代物，乳糖乳杆菌制剂就是其中一种重要的研究对象[3]。大量研究表明，乳酸菌具有改善饲料适口性，调节肠道菌群，抑制肠道内腐败菌生长繁殖，消除体内有毒物质的产生，改善便秘、肝功能和维生素代谢，提高免疫功能等作用[4-6]。但是，在实际生产中乳酸菌制剂的饲用效果不完全一致[7-9]。笔者认为，目前乳酸菌制剂生产还没有国家标准，市场上的产品质量不稳定，进而影响产品使用效果。本研究对饲用乳糖乳杆菌的培养条件进行了优化研究，给乳酸菌发酵饲料的标准化生产提供优质一级菌种。

1 材料和方法

1.1 试验时间与地点

2016年5—6月在罗牛山股份有限公司博士后科研工作站实验室进行试验。

1.2 菌种

由罗牛山股份有限公司博士后科研工作站菌种保藏中心提供。

1.3 试验设备

振荡培养箱（SHZ-A型，上海跃进医疗机械厂）；生化培养箱（DHP120型，上海实验仪器总厂）；高压灭菌器（MLS-3750型，日本三洋电子有限公司）；磁力搅拌器（JB-3型，上海智光仪器仪表有限公司）；便携式pH计（PHB-3型，上海伟业仪器厂）；生物洁净工作台（SA-960-2型，上海上净净化设备有限公司）；721可见紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。

1.4 培养基

种子培养基（MRS培养改良基）[10]：蛋白胨10 g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸铵2.15g，Tween801mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4· 4H2O 0.05 g，K2HPO42 g，琼脂粉17 g，水1 000 mL。

1.5 培养条件优化

菌种活化：从冰箱中取出乳糖乳杆菌斜面菌种，室温静置活化40 min。而后用接种环取种两环接种于装有10 mL MRS改良液体培养基的试管中，37℃静止培养12 h，备用。

1.5.1 静置培养和摇床培养对比（培养时间X的确定）按1.0%接种量将活化的种子接种于装有100 mL MRS改良液体培养基的250 mL三角瓶中，37℃静置培养和60 r/min振荡培养60 h，每隔12 h取1次样（先摇匀后取样），在610 nm处测定培养液OD值。

1.5.2 培养基起始pH的筛选以6 mol/L的HCl或NaOH溶液将MRS改良培养基的起始pH分别调节为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.0，接入1.0%的乳糖乳杆菌活化菌液，37℃下恒温培养X h，在610 nm处测定菌液OD值。

1.5.3 培养温度的筛选将100 mL的MRS改良液体培养基中接入1.0%的乳糖乳杆菌活化菌液，分别于30、35、40、45℃下恒温培养X h，在610 nm处测定菌液OD值。

1.5.4 接种量的确定按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接种量接乳糖乳杆菌活化菌液后静置培养X h取样，测定培养液OD值。

1.6 培养基成分的优化

蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和葡萄糖是影响培养基成本的主要成分。因此，本试验设计L16（45）正交试验，确定乳糖乳杆菌培养基成分，试验设计见表1。

表1 L16（45）正交设计因素

1.7 试验数据的统计

用Excel 2007对试验数据进行统计分析和图表处理。

2 结果与分析

2.1 乳糖乳杆菌静置培养和摇床培养对比及培养时间的确定

从表2和图1可知，静置和摇床培养的菌液起始OD值一样，随着培养时间的延长OD值逐渐变大。静置和摇床培养在0～12 h内生长比较缓慢，12～48 h内生长较快，菌种生长进入对数生长期，48 h时OD值几乎接近峰值，静置培养可以达到1.260，优于摇床培养，48 h后逐渐接近平稳。试验结果说明，乳糖乳杆菌是厌氧菌，符合乳酸菌多数属于厌氧菌或微好氧菌的结论[11]，该乳糖乳杆菌的最佳培养时间是48 h。

表2 静置和摇床培养乳糖乳杆菌菌液OD值对比

图1 静置和摇床培养乳糖乳杆菌菌液OD值对比

2.2 培养基起始pH的确定

将乳糖乳杆菌接种于不同起始pH的培养基中静置培养48 h，测定菌液OD值结果见表3。从表3可以看出，乳糖乳杆菌对酸碱环境的适应能力较强，pH 4.5～9.0都可以生长。当pH小于5.5或大于8.5时生长较好，而在pH 5.5～7.5范围内生长较慢。pH 4.5与pH 9.0时生长较好，pH 9.0时OD值达到1.568，相对最高。许多研究表明[12-15]，乳酸菌在pH 4.5～8.0范围内生长良好。而本试验结果最适初始pH约在9.0时乳糖乳杆菌生长最好，应该是该菌特性。

表3 不同起始pH乳糖乳杆菌菌液的OD值

2.3 培养温度的确定

将乳糖乳杆菌培养液分别置于30、35、40、45℃下恒温培养48 h，测定的OD值结果见表4。

表4 不同温度下乳糖乳杆菌培养液OD值

从表4可以看出，随着温度的提高乳糖乳杆菌菌液的OD值先增高后降低。李艾黎等[16]用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为对象，研究了不同培养温度（37、42、45℃）对其混合生长的影响。试验证实培养环境为42℃时，不仅有利于酸奶菌种混合培养时的球杆菌比例平衡，其生长速率也有显著提高。李志成等[17]以脱脂乳为基础培养基，选用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种在30、34、37、42℃发酵，研究发酵温度对冻干酸奶发酵剂活菌数的影响。结果表明，不同发酵温度下制得的冻干发酵剂活菌数有显著差异，尤其是在30℃发酵制得的冻干发酵剂其活菌数显著高于其他发酵温度，其冻干发酵剂活菌数高达4.2×1011cfu/g。熊素玉等[18]用改良MC培养基为载体，对分离到的24株菌进行最适培养条件的研究。结果表明，最适生长温度大概在40℃左右，但在各菌株间略有差异。张建国等[19]研究表明，试验用乳酸菌在40℃时效果略好于20和30℃。张兰威等[20]研究了培养温度（38、41、44℃）对保加利亚杆菌嗜热链球菌混合培养的影响。结果表明，较高温度（44℃）有利于中利亚杆菌生长，且混合培养的总菌数多。即高温度（44℃）可以促进混合培养中保加利亚杆菌和嗜热链球菌快速生长。综合上述，乳酸菌最适温度在30～44℃之间，因菌株不同而各异。本试验用的饲用乳糖乳杆菌在35与40℃时生长OD值相差不大，根据试验实际需要，本试验最终选用35℃作为饲用乳糖乳杆菌的培养温度。

2.4 接种量的确定

按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接种量，接种乳糖乳杆菌活化菌静置培养48 h，测定OD值结果见表5。

从表5可以看出，随着接种量的增多，OD值也逐渐变大。当接种量为0.5%时OD值平均值为0.583，接种量为2.0%时OD值平均值为1.430，明显高于0.5%的接种量，所以本次试验采用了2.0%的接种量。

表5 不同接种量乳糖乳杆菌菌液的OD值

李剑芳等[21]通过正交设计试验确定乳酸菌最优接种量为1.0%。邵亚东等[22]为制备高浓度乳酸菌发酵剂，按1.0%接种量接种乳酸菌，可以使乳酸菌活菌数的对数值达到108～109cfu/mL以上。赵玲艳等[23]从辣椒中提取的乳酸菌用于辣椒发酵时的最佳接种量为1.0%。

2.5 最适培养基成分的确定

从表6试验数据可知，在乳糖乳杆菌生长最佳条件（温度35℃，时间48 h，接种量为2.0%）下，组合A2B1C2D3（蛋白胨8 g，酵母提取物3 g，牛肉膏8 g，葡萄糖20 g）测出的OD值最大，即1.614。但经过分析结果，乳糖乳杆菌实际最佳的培养基组合应为A2B4C2D1（蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g）。因该组合不在实际操作组合中，所以进行了1次验证试验。结果表明，A2B4C2D1组OD值为1.638，大于A2B1C2D3组合OD值，即乳糖乳杆菌最适合生长培养基成分为蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g。影响生长因子次序为酵母提取物＞葡萄糖＞蛋白胨＞牛肉膏。