淫羊藿苷抑制小鼠腰椎间盘退变机制研究

[摘要]目的：建立腰椎间盘退变小鼠模型，观察淫羊藿苷对Ⅱ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶表达影响，从而研究能改善腰椎间盘退变的机制。方法：随机选取60只大鼠，分成对照组、假手术组、淫羊藿苷组、活血止痛组，假手术组仅切开不穿刺，其余三组采用纤维环穿刺法建立椎间盘退变模型。四组分别灌胃生理盐水、生理盐水，淫羊藿苷、活血止痛胶囊，剂量均为6g/kg·d。结果：COL-Ⅱa上，假手术组最高，对照组最低，淫羊藿苷组、活血止痛组相近；MMP-13、TIMP-1mRNA上，对照组最高，假手术组最低，淫羊藿苷组、活血止痛组相近，COL-Ⅱa、MMP-13、TIMP-1mRNA三个指标中，假手术组和其他三组比较差异显著（p<0.05），对照组和淫羊藿苷组、活血止痛组比较差异显著（p<0.05），淫羊藿苷组和活血止痛组比较差异无统计学意义（p>0.05）。结论：淫羊藿苷能影响MMP-13、TIMP-1mRNA表达，从而改善腰椎间盘退变。

[关键词]淫羊藿苷；小鼠；腰间盘退变

[DOI]10.13939/j.cnki.zgsc.2016.31.297

腰椎间盘疾患是临床上发病率很高的疾病，临床表现为腰腿痛、下肢感觉异常等症状，严重影响人们的生活质量。腰椎间盘由纤维环、髓核等组成，主要是胶原蛋白和水分，其中胶原蛋白有Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰa）、Ⅱ型胶原蛋白（COL-Ⅱa），外层主要是COL-Ⅰa，其有较强韧性，能抗张力，椎间盘能抗较强压力，内层有较好的保水能力，能缓冲椎间盘受到的压力。而椎间盘病变则是胶原蛋白逐渐下降引起。研究[1]称，生化机制在椎间盘退变中扮演重要角色，炎症因子能促进基质金属蛋白酶-13合成，抑制金属蛋白酶组织抑制剂-1合成，通过使用有抗炎作用淫羊藿苷处理腰椎间盘退变模型小鼠，观察其是否能够影响基质金属表达，延缓椎间盘退变过程。

1材料与方法

1.1实验材料

（1）实验动物：随机选取60只小鼠，均为雄性，平均体重为（15±20）g。

（2）实验试剂：淫羊藿苷标准品由成都领航者生物技术有限公司生产，纯度>98%；RT-PCR试剂盒购自上海星科生物技术有限公司。

1.2实验方法

（1）干预分组：将60只小鼠随机分成4组，每组为15只，均饲养1周后禁食12h以上。

（2）模型建立：参考文献[2][3]内容建立椎间盘退变模型，先将小鼠用5mL水合氯醛腹腔注射麻醉，后将其仰卧固定在操作台上，在正中线左侧1cm附近中部切1.5cm 左右的刀口，将腹肌分离后剪开腹膜再用纱布将鼠的内脏推向对侧，将腰大肌分离后使前纵韧带暴露，即可找到腰4椎间盘，对假手术组直接进行逐层缝合即可。其余三组则用针刺法进行造模。术后1周对四组喂服淫羊藿水提液、生理盐水和活血止疼药，假手术对照组喂服生理盐水。8周后处死试验动物，取出模型椎间盘放入4%多聚甲醛切片固定后进行观察。

（3）模型验证：参考《实用骨科学》诊断标准，经影像学检查诊断验证。

1.3方法

（1）观察指标。用番红-固绿染色观察椎间盘形态学变化情况。取出椎间盘置于液氮中进行保存，用逆转录-聚合酶链反应法检测COL-Ⅱa、MMP-13、TIMP-1mRNA表达情况。

（2）统计学处理。应用SPSS15.0统计软件进行统计学处理。

2结果

2.1四组镜下染色观察结果

假手术组髓核组织结构完整，基质成分疏松，髓核细胞较多，胶原纤维走形较为清楚，细胞核结构完整。对照组髓核组织皱缩，基质成分较少，胶原纤维粗大，走形紊乱，髓核细胞明显减少，细胞核不完整。淫羊藿苷组则髓核组织成分减少，胶原纤维粗大，活血止痛组较淫羊藿苷组胶原纤维略小。

2.2四组相关指标比较

COL-Ⅱa上，假手术组最高，对照组最低，淫羊藿苷组、活血止痛组相近，假手术组和其他三组比较差异显著（p<0.05），对照组和淫羊藿苷组、活血止痛组比较差异显著（p<0.05）；MMP-13、TIMP-1mRNA上，对照组最高，假手术组最低，淫羊藿苷组、活血止痛组相近，假手术组和其他三组比较差异显著（p<0.05），对照组和淫羊藿苷组、活血止痛组比较差异显著（p<0.05），淫羊藿苷组和活血止痛组在COL-Ⅱa、MMP-13、TIMP-1mRNA上比较差异无统计学意义（p>0.05），见下表。

3讨论

研究[4]称，MMP-13可直接降解纤维环中的胶原蛋白。有学者通过对退变小鼠腰椎间盘分化成脂肪细胞抑制作用观察到其对MMP-1的激活作用[5]，MMP-1和MMP-13在正常情况下是处于动态平衡的，COL-Ⅱa下降则降低氧化物酶体增生物激活受体mRNA水平，且其存在剂量依赖性。结果显示，MMP-13水平上以假手术组最低，对照组最高，可见MMP-13是以降低MMP-13活性来达到保护COL-Ⅱa作用的。

研究[6]称，TIMP-1 mRNA能通过干扰COL-Ⅱa信号通路从而抑制COL-Ⅱa活性和连接蛋白表达，造成椎间盘退变。报道[7]认为，抑制ERK1表达能下调TIMP-1mRNA表达，上调Ⅱ型胶原蛋白聚糖表达，其中炎症指标能通过活化转录因子1复合体上调TIMP-1mRNA。COL-Ⅱa下降后会诱导TIMP-1mRNA表达升高，调节椎间盘重塑和纤维环细胞表型变化，能促使软骨生长和成熟。通过激活纤维环中细胞经典通路从而造成其肥大和基质矿化，从而升高TIMP-1 mRNA水平。[8][9]

淫羊藿苷是以从淫羊藿属植物淫羊藿中提取的总黄酮为主要有效成分，其在抗肿瘤、增强机体免疫力，改善心血管功能，调节内分泌等方面具有重要药理学作用。[10]其对腰椎间盘影响性机制可能是通过刺激MCT-E1细胞中mRNA数量增加，从而促进成骨细胞分泌细胞因子TGF-mRNA表达，抑制TNF-α，调节其增殖和分化，促进基质合成和分泌，促进椎间盘胶原蛋白恢复。[11][12]

结果显示，采用淫羊藿苷后能提高COL-Ⅱa水平，能降低MMP-13、TIMP-1mRNA，从而对退变的腰椎间盘有改善作用。故可作为临床上改善退变椎间盘的药物之一。

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[作者简介]石依姗（1995—），女，河南洛阳人，本科，四川农业大学农学院。研究方向：中草药栽培与鉴定。

[BP（]以下是尾注。[BP）]

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[作者简介]王凯敏，女，汉族，中国地质大学（北京）马克思主义学院思想政治教育专业硕士研究生；马海军，男，汉族，法学博士，中国地质大学（北京）马克思主义学院副教授。主要从事马克思主义中国化和党的建设研究。

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[8]《列宁选集》第43卷[M].北京：人民出版社，1987.

[作者简介]王乐昌（1990—），男，汉族，山东聊城人，中国地质大学（北京）马克思主义学院硕士研究生。研究方向：马克思主义基本原理。