杏鲍菇超氧化物歧化酶部分酶学性质研究

陈国忠,程仕伟,祝 玲,刘艳玲,程显好,刘进杰,*

(1.鲁东大学生命科学学院,山东烟台 264025;2.鲁东大学农学院,山东烟台 264025)



杏鲍菇超氧化物歧化酶部分酶学性质研究

陈国忠1,程仕伟1,祝 玲1,刘艳玲1,程显好2,刘进杰1,*

(1.鲁东大学生命科学学院,山东烟台 264025;2.鲁东大学农学院,山东烟台 264025)

研究了杏鲍菇不同部位超氧化物歧化酶(SOD)活力的差异,以及pH、温度、金属离子和有机试剂对SOD酶活性的影响。结果表明:菌盖和菌褶SOD酶活力显著高于菌柄,外皮高于心部;杏鲍菇SOD在pH5～8范围内活性稳定,具有良好的耐热性;Cu2+、Zn2+、Fe2+和Mn2+对SOD酶活力具有不同程度的激活作用,其中Cu2+的激活作用最突出;甲醇、乙醇和正丁醇对SOD活性的影响均为低浓度激活、高浓度抑制,而丙酮则表现出抑制作用。可见杏鲍菇SOD酶活力受到pH、温度、金属离子和有机溶剂等多种因素的影响。

杏鲍菇,超氧化物歧化酶,酶活力,影响因素

超氧化物歧化酶(SOD)是广泛存在于生物体中的一类金属酶,它能有效清除体内的氧自由基,增强机体抗辐射损伤能力,防御氧毒性,抗衰老,在一些肿瘤、炎症、自身免疫疾病等治疗中有良好的疗效[1]。SOD存在分子量大、半衰期短、易失活等缺点,在提取、储存和使用过程中受到pH、温度、金属离子和有机溶剂等多种外界因素的影响[2]。杨学山等发现金属离子在体外对羊血SOD酶活产生激活或抑制作用[3],海藻糖对羊血SOD活性有明显的激活和保护作用[4]。谢晓兰等发现甲醇、乙醇、正丙醇等有机溶剂的存在均引起酶构象的改变,对猪血SOD酶活力表现出激活或抑制作用[5]。目前相关研究大多集中在动物来源SOD上,是因为长期以来动物血液一直是提取SOD的主要原料[6]。然而由于各种病源及外源污染,国际社会已禁止从动物血液中提取SOD用于人体,于是近年来研究者将目光投向了植物[7-8]和微生物[9-10]。

杏鲍菇、双孢蘑菇等食用菌SOD的提取分离和部分性质已有文献报道[11-13]。研究者发现,杏鲍菇SOD热稳定性突出[14],且4 ℃贮藏18 d SOD活性基本保持不变[15],具有良好的开发应用前景。本文比较了不同部位杏鲍菇SOD酶活力的差异,考察了pH、温度、金属离子和有机溶剂对杏鲍菇SOD活性的影响,对于杏鲍菇SOD的生产加工和贮藏使用等具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杏鲍菇 超市；Tris、NBT、邻苯三酚、甲硫氨酸等试剂 均为分析纯；核黄素 惠兴生化试剂有限公司。

CP214电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;KQ-500DB数控超声波破碎仪 昆山市超声仪器有限公司;PhilipsHR2004/70搅拌机 飞利浦电子香港有限公司;5810R离心机 上海艾本德生物技术国际贸易有限公司;4000Lx荧光灯 深圳市诺锐软管有限公司;XMTD-2MA电热恒温水浴锅 龙口市先科仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杏鲍菇SOD的提取 取新鲜杏鲍菇10.00 g,切成2 mm左右的小块,放入搅拌机中,加入0.05 mol/L pH7.6磷酸缓冲液30 mL,粉碎至糊状,全部转移至250 mL烧杯中,置于超声波破碎仪中120 W处理5 min,4 ℃ 10000 r/min离心10 min,取上清液,加入0.25体积的氯仿-乙醇(3∶5,v/v)混合液搅拌15 min,5000 r/min离心15 min,上清液加入等体积的冷丙酮,搅拌15 min,5000 r/min离心15 min,沉淀溶于0.05 mol/L pH7.6磷酸缓冲液中,得SOD粗酶液。

1.2.2 杏鲍菇SOD的纯化 将杏鲍菇SOD粗酶液上DEAE-FF柱(1.5 cm×50 cm),用0.05 mol/L Tris-HCl洗脱液(pH7.6)洗脱,流速60 mL/h,每管收集5 mL,测定酶活,合并酶活力吸收峰,超滤浓缩,10000 r/min离心10 min,弃去沉淀取上清液上Sephadex G-100柱(1.0 cm×50 cm),用0～100 mmol/L Tris-HCl洗脱液进行梯度洗脱,流速为20 mL/h,每管收集3 mL,合并酶活力吸收峰得SOD纯化酶液,置于-20 ℃冷冻备用。

1.2.3 杏鲍菇SOD酶活影响因素的研究 杏鲍菇不同部位SOD酶活的比较:分别取杏鲍菇的菌盖、菌褶、菌柄、外皮(表层以下2～3 mm)和心部10.00 g,按1.2.1步骤提取SOD得粗酶液,测定酶活力。

pH对杏鲍菇SOD酶活的影响:分别配制pH3、4、5、6、7、8、9、10、11的Tris-HCl缓冲液,加入等体积SOD纯化酶液,于25 ℃水浴保持2 h,测定酶活力。

温度对SOD活性的影响:取1.0 mL SOD纯化酶液于试管中,分别置于20、40、60、80、100 ℃水浴锅中,每隔10 min取出1管测定SOD酶活力。

金属离子对SOD活性的影响:在SOD纯化酶液中分别加入CuSO4、ZnSO4、FeSO4和MnSO4溶液,使得酶液中金属离子的终浓度梯度为0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、3.0 mmol/L,充分混匀后静置1 h,分别测定酶活力。

有机溶剂对杏鲍菇SOD活性的影响:在SOD酶液中分别加入不同比例的甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮,酶液与有机溶剂的比例分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2,最终反应体系中有机溶剂浓度分别为25%、33%、50%、67%,充分混匀后静置1 h,分别测定酶活力。

1.2.4 SOD酶活力的测定 采用氮蓝四唑光还原法[16]测定SOD酶活力。一个酶活力单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半(50%)时所用的酶量。取25 mL试管4支,2支为对照管,依次加入0.05 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液3 mL、130 mmol/L Met溶液0.6 mL、750 μmol/L NBT溶液0.6 mL、100 μmol/L EDTA-Na2溶液0.6 mL、20 μmol/L 核黄素0.6 mL、酶液0.2 mL(对照以磷酸缓冲液代替)、蒸馏水1.0 mL,混匀后将1支对照管放置暗处,其他各管于4000 Lx荧光灯下反应20 min,要求各管受光情况一致,反应温度控制在25～35 ℃之间,视酶活性高低适当调整反应时间。反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其他各管的吸光度,按下式计算SOD活性:

式中:A0为照光对照管的吸光度;As为样品管的吸光度;VT为样液总体积(ml);V1为测定时样品用量(ml);mf为样品鲜重(g)。

1.2.5 数据分析 实验数据以3个平行组数据的平均值表示,并计算标准偏差。用Origin8.0作图,SPSS(19.0)对数据进行统计分析,采用ANOVA进行Duncan’s差异分析,以p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇不同部位SOD酶活力的比较

分别取杏鲍菇的菌盖、菌褶、菌柄、外皮(表层以下2～3 mm)和心部,提取SOD检测酶活力。由图1可知,杏鲍菇不同部位SOD酶活力不同。菌盖部分的SOD酶活力最高,菌柄则最低,外皮SOD酶活力高于心部。这可能与杏鲍菇的形态特征和SOD的生物学功能有关。SOD的主要功能是清除细胞内由于线粒体氧化呼吸作用产生的一些超氧化物。菌盖和外皮位于杏鲍菇的最外层,与空气接触面积最大,含有较多的SOD以清除产生的自由基,而菌柄部分埋在土里,与空气接触较少,呼吸作用没有菌盖旺盛,相应的含SOD也较少[17]。

图1 杏鲍菇不同部位SOD酶活力Fig.1 SOD activity from various parts of Pleurotus eryngii注:不同小写字母代表差异显著(p<0.05)。

图2 pH对SOD酶活力的影响Fig.2 Effect of pH on SOD activity

2.2 pH对杏鲍菇SOD活性的影响

考察了不同pH条件下杏鲍菇SOD活性。由图2可知,在pH3～8范围内,SOD酶活力随pH升高而增大,在pH8时酶活力达到最高,此后随着pH升高SOD酶活力迅速下降。在pH5～8范围内酶活力较高,稳定性较好,表明杏鲍菇SOD对pH的适应范围较广。这与文献报道其它来源SOD的酸碱稳定性相似[18-19]。

2.3 温度对SOD活性的影响

研究了杏鲍菇SOD酶活力在不同温度下随时间的变化规律。由图3可以看出,杏鲍菇SOD酶活力在20 ℃条件下可保持较长时间无显著降低,但随着温度升高和时间延长酶活力呈下降趋势。不过与其它类型SOD[15]相比,杏鲍菇SOD属于耐温型,其热稳定性高,在100 ℃条件下处理50 min后SOD酶活力仍能保留48.30%。除了杏鲍菇SOD本身的热稳定性之外,杏鲍菇含有较高含量的海藻糖[20],可能对SOD产生激活和保护作用[4]。由此可见,低温贮存有利于SOD酶活力的保持[21]。

图3 温度对SOD酶活力的影响Fig.3 Effect of temperature on SOD activity

2.4 金属离子对SOD活性的影响

SOD是一种金属酶,金属离子对维持酶的分子结构及催化活性有重要作用[22-24]。根据金属辅基的不同,可将SOD分为3 类:Cu·Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。根据文献报道,杏鲍菇SOD主要类型为Mn-SOD[25],兼有Cu·Zn-SOD[11]。本文考察了外源添加Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+对杏鲍菇SOD酶活力的影响,结果见图4。Mn2+对杏鲍菇SOD有激活作用,但是并非最佳的金属离子激活剂,Cu2+和Fe2+表现出更加显著的激活作用,特别是当Cu2+浓度为1 mmol/L时SOD酶活力比对照提高了43.70%,此时继续增大Cu2+浓度则变化不大。Zn2+浓度在0.01～1 mmol/L之间对SOD活力具有明显的激活作用,但是当浓度继续增大时激活作用明显减弱,表明只有适宜的Zn2+浓度才能发挥最佳的激活作用。由此可见SOD酶活力与其金属辅基的离子浓度并不成正比例关系,类似的研究已有报道,比如杨学山等[3]发现Cu2+、Zn2+对羊血Cu·Zn-SOD有抑制作用。原因可能是某些金属离子能和SOD活性中心的金属辅基发生诱导、置换等反应形成新的配位化合物,或者发生拮抗作用,从而激活或抑制酶活性[3]。

图4 金属离子对SOD酶活力的影响Fig.4 Effect of metal ions on SOD activity

2.5 有机溶剂对SOD活性的影响

如图5所示,甲醇、乙醇和正丁醇均表现为在低浓度时对SOD酶活力有激活作用,随着浓度增加激活作用逐渐增大,达到最大值后激活作用下降,并最终转变为抑制作用。究其原因,可能是因为在低浓度下这3种醇有利于酶与底物的接触,促进底物和产物的分配和扩散,从而间接提高酶的催化活性;而随着有机溶剂浓度增加,醇溶解大量的水,破坏酶表面必需的水化层,醇直接与酶作用,破坏酶蛋白活性构型的氢键、疏水作用等而导致酶活性降低[26]。丙酮在低浓度时对SOD酶活力的影响并不显著,但在其浓度高于25%之后表现出抑制作用。关于丙酮影响SOD酶活力的研究未见报道,推测其作用原理可能是丙酮破坏酶分子表面的水化层导致酶失活。

图5 有机溶剂对SOD酶活力的影响Fig.5 Effect of organic solvent on SOD activity

3 结论

SOD酶是一类重要的抗氧化金属酶,其活性分布在杏鲍菇中表现出不均一性,外皮>心部,菌盖>菌褶>菌柄,尽管如此生产过程中产生的边角料仍有较高的利用价值。杏鲍菇SOD在pH5～8之间酶活力较高,pH小于5或大于8活性显著降低。高温环境不利于SOD酶活力的保存,但相比文献报道中其他动植物来源的SOD,杏鲍菇SOD表现出良好的温度耐受性,在贮存和加工过程中有利于延长SOD产品的有效期。Cu2+、Fe2+和Zn2+对杏鲍菇SOD的激活作用明显高于Mn2+,表明添加适量浓度的外源金属离子能够提高SOD酶活力,其类型与金属辅基并不一致,如何选择合适的金属离子作为SOD激活剂需要进一步的理论和实验研究。低浓度甲醇、乙醇和正丁醇对SOD活性有激活作用,表明适宜浓度的有机溶剂比水更适合作为SOD的催化反应体系。

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Study on properties of superoxide dismutase activity fromPleurotuseryngii

CHEN Guo-zhong1,CHENG Shi-wei1,ZHU Ling1,LIU Yan-ling1,CHENG Xian-hao2,LIU Jin-jie1,*

(1.College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China; 2.College of Agriculture,Ludong University,Yantai 264025,China)

Superoxidedismutase(SOD)activityindifferentpartsofPleurotus eryngiiwascompared.SeveralfactorsaffectingthestabilityofSODincludingpH,temperature,metalionsandorganicreagents,werestudied.TheresultsshowedthatSODenzymeactivitiesinpileusandgillwerehigherthanthatinstipe,theskinhigherthancoresection.ThisenzymedisplayedgoodstabilityatthepHrangefrom5to8andgoodthermalstability.Cu2+,Zn2+,Fe2+andMn2+showeddifferentdegreesofactivationonSODenzymeactivity,inwhichtheactivationofCu2+wasthemostprominent.Methanol,ethanolandn-butylalcoholshowedactivationinlowconcentrationbutinhibitoryeffectinhighconcentration,whileacetoneshowedinhibitoryeffect.ThereforeSODactivityofPleurotus eryngiiwereinfluencedbymanyfactorsincludingpH,temperature,metalionsandorganicsolvents.

Pleurotus eryngii;superoxidedismutase(SOD);enzymeactivity;influencefactors

2016-04-25

陈国忠(1980-)，男，博士，讲师，研究方向：生物化学工程，E-mail：guozhongch@126.com。

*通讯作者:刘进杰(1978-)，女，硕士，讲师，研究方向：食品工程，E-mail：jinjie78@126.com。

鲁东大学科研基金项目(27710301);城新创新基金(CXJ-06)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0176-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.026