复合酶水解法从罗非鱼血液中提取血红素及其性质研究

2016-12-19岑剑伟胡庆蓉杨贤庆李来好

食品工业科技 2016年19期

岑剑伟,胡庆蓉,魏涯,杨贤庆,黄卉,李来好,*

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室, 国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300; 2.汕头市质量计量监督检测所,广东汕头 515063)

岑剑伟1,胡庆蓉2,魏涯1,杨贤庆1,黄卉1,李来好1,*

为更加科学有效地利用中国丰富的罗非鱼血液资源,本文建立了一套经复合酶水解、再通过酸沉淀和真空冷冻干燥等步骤,从罗非鱼血液中提取血红素的新工艺。在此条件下,血红素提取率达到80.9%,产品纯度为28.2%,同时对所得产品的光谱特征、分子量大小、铁离子价态和外观性状等物理性质进行了研究。结果分析表明:产品特征波长为385 nm,特征成分为血红素,产品中约20%的血红素以与大分子肽链结合的形式存在,相对分子量在5～10 ku范围内,而约75%的血红素则可能以单体或者与小分子肽链结合的形式存在,相对分子量小于5 ku;产品中二价铁残留率为37%,在提取过程中应加强二价铁的保护,相关研究结果可以为罗非鱼血液中血红素的开发应用提供重要的理论依据和技术支撑。

罗非鱼血,血红素,复合酶,提取,性质研究

中国是世界上最大的罗非鱼养殖生产国家,2014年我国罗非鱼产量达到155万t,其中约有50%的产品用于加工生产,然而被工厂当作废水排放的罗非鱼血达1.6×104t[1-2],造成资源的巨大浪费和引发严重的环境污染问题。血红蛋白(hemoglobin,Hb)是罗非鱼血液中含量最高的一类蛋白(约占血液总蛋白的80%),它由血红素与珠蛋白结合成四聚体(两条α链和两条β链)的形式存在,相对分子质量约为65000,其中珠蛋白约占96%,血红素占4%[3]。血红素(Heme)是由1个原卟啉环中镶嵌1个亚铁离子(Fe2+)构成的化合物,分子式为C34H32FeN4O4,相对分子量为616.49。它参与机体的多项代谢活动,发挥着重要的生理功能[4],因此,在食品、医药和化工等领域得到了广泛的应用:如添加到糖果、面食、酱油和肉制品等食品中,能够在不影响食品原有品质的同时有效地起到补铁的作用,改善肉制品的外观和口感[5-7];血红素作为制备胆红素的前体,可作为制备抗癌特效药-血卟啉衍生物的主要原料等[8]。

因此,本文以罗非鱼血为原料,在对酶种类、酶浓度、底物浓度、酶解时间等酶解工艺条件进行研究的基础上,采用复合酶水解法的最佳工艺条件处理血红蛋白[9],再经过酸沉淀和离心等操作提取血红素,并通过紫外-可见光谱扫描图谱分析、高效液相色谱定性分析、超滤技术定性分析、Fe2+/Fe3+组成分析和外观性状观察等实验,对产品的光谱特征、分子量大小、含量和外观性状等性质进行研究。旨在为罗非鱼血液资源综合利用研究提供可靠的理论和技术支撑,具有重要的理论研究价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼广州华润万家超市新港西路店,鲜活,约500 g/尾;血红素标准品 Sigma公司,生物试剂;氢氧化钠、冰醋酸广州化学试剂厂,分析纯;1%乙酸、四氢呋喃美国TEDIA公司,色谱纯;邻菲罗啉试剂广州康龙生物技术有限公司,分析纯;复合蛋白酶广州齐云生物技术有限公司,生物试剂。

Agilent 1100高效液相色谱工作站 Agilent公司;AA-6300C型原子吸收分光光度计岛津(SHIMADZU)公司;UV-2450/2550型紫外-可见分光光度计岛津(SHIMADZU)公司;Milipore Labscale超滤超滤系统 Milipore公司;ALPHA 1-4 LSC 冷冻干燥机德国Christ公司;XSP-2C双目型显微镜上海蔡康光学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 血红素含量测定紫外-可见分光光度法(UV)[10]。

2 结果与讨论

2.1 血红素提取工艺分析

通过碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶提取血红素效果对照实验表明,复合酶的提取率最高。因此,本实验选用复合酶酶解提取血红素,其最适反应pH为8.0,最适反应温度为40 ℃[9]。通过对酶解底物浓度、酶底比和酶解时间三个主要影响因子进行单因素实验和L9(34)正交实验,确定的最佳酶解工艺条件为底物浓度6%、酶底比8000 U/g,酶解时间2 h[9]。

血红蛋白经水解后,所得水解液中含有多种成分,包括血红素、血红素肽结合体和各种肽片段等。酶解反应结束后进行沸水浴处理,可以使酶变性失活,终止酶解反应,又可以使热不稳定性物质(如血红蛋白)变性沉淀。因此,通过沸水浴处理后离心可以起到较好的除杂作用。根据文献报道,血红素不溶于酸性溶液中,在酸性条件下会发生沉淀[13];同时,珠蛋白在等电点pH3.0附近时会与血红素发生解离,从而使血红素肽的结构遭到破坏;同时血红蛋白水解液中肽片段的等电点约为4.7[14]。调节pH6.0不仅可以使血红素单体和血红素肽充分沉淀,而尽量减少其他肽链沉淀,有效的提高血红素的得率;同时因为远离了珠蛋白等电点,又不会使血红素肽因解离而失去功能活性。按照上述工艺条件操作,通过测定各步骤中血红素含量和干物质重量,可计算相关评价指标变化情况如表1。

表2 超滤中的血红素含量测定结果

Table 2 Content determination results of heme during utrafiltration

膜孔径(ku)50105血红素含量(mg/L)4453±014337±013398±01血红素通过率(%)987961753

表1 血红素提取过程中各指标变化情况

Table 1 The variation of indexes during extraction of heme

评价指标样品准备复合酶水解酸沉淀血红素含量(g)067505690546干物质重量(g)18000133291934血红素提取率(%)100843809纯度(%)3843282

由表1可知,血红细胞液经复合酶水解和酸沉淀后,血红素提取率为80.9%,样品纯度为28.2%。张亚娟[14]等报道的血红素提取率为57.5%,纯度为24.47%。吴保承[15]等报道的血红素提取率为77.2%。与现有文献报道相比,本文中血红素提取率、纯度均达到较高水平。

2.2 血红素产品物理性质分析

酶法制备的产品中血红素含量为28.2%,其可能包含几种成分:(1)血红素肽结合体;(2)血红素单体;(3)难分离的肽链等。为了进一步明确产品的组成成分和有关物理特征,实验通过紫外-可见光谱扫描图谱分析、高效液相色谱定性分析、超滤技术定性分析、Fe2+/Fe3+组成分析和外观性状分析等对产品的物理性质做相关研究。

2.2.1 紫外-可见光谱扫描图谱分析由图1可见,样品的光谱扫描图谱与血红素标准品的图谱峰型基本一致,且其特征吸收波长为385 nm,与文献[10,14-15]报道的血红素特征波长一致,表明样品中的特征性成分为血红素;样品峰面积稍大于标准品,而两者的浓度比为5∶1,可大致推断出样品中血红素含量大于且接近20%,与测定值28.2%相吻合,证实了上述结果的准确有效性。

图1 血红素样品与标准品的紫外-可见光谱Fig.1 UV-Vis curve of heme product and the standard

2.2.2 高效液相色谱定性分析流动相的性质和组成是影响色谱柱效、分离选择性的重要因素。目前文献报道的HPLC法测定血红素时,流动相多采用乙腈、甲醇和水等[14]。考虑到血红素与色谱柱产生较强作用导致拖尾,直接影响测定结果的准确性,因此,本实验采用1%乙酸和四氢呋喃为流动相,可有效克服图谱的拖尾现象。用高效液相色谱法测定血红素,检测波长在385 nm处时色谱峰的分离不如405 nm,因此将此法检测波长定为405 nm。

由图2可知，峰形良好,且只有一个峰;血红素标准品的保留时间为7.074 min,峰面积为1030 mAU·mL;样品的保留时间为7.160 min,峰面积为987 mAU·mL,由此可知,样品的保留时间和峰面积均与血红素标准品一致,表明样品中的特征性成分为血红素,且含量与紫外-可见分光光度法测定结果一致,为28.2%。

图2 血红素标准品(a)和样品(b)的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of heme standard(a)and the product(b)

2.2.3 超滤定性分析超滤前的血红素含量为45.12 mg/L,由表2可知,经过50 ku和10 ku的膜处理后,血红素含量变化不明显,只有很小的一部分被截留,表明绝大多数的血红蛋白被水解成了多肽链;经过5 ku的膜处理后,血红素含量为超滤前的75.3%。表明产品的分子量主要集中分布在两个范围:一是5～10 ku,这部分约占血红素总量的20%,主要是血红素与大分子肽链的结合物;二是小于5 ku,这部分约占血红素总量的75%,可能含有血红素单体或者血红素和小分子肽链的结合物。

2.2.4 Fe2+和Fe3+含量分析铁原子在血红蛋白中与血红素以Fe2+的形式结合,酶解和分离纯化过程中,血红蛋白原有的稳定结构被破坏,使Fe2+更容易与氧气接触而氧化成Fe3+等高价铁[4]。由表3可知,样品中60%的铁被氧化成Fe3+,由于Fe2+比Fe3+对人体的作用更为关键,因此,在产品生产过程中应该加强二价铁的保护。

表3 样品中Fe2+和Fe3+含量

Table 3 The content of Fe2+and Fe3+in the sample

铁元素类型总铁Fe2+Fe3+浓度(mg/L)0392±0010147±00050235±0005比例(%)1003760

2.2.5 外观性状分析在显微镜下观察,血红素标准品为紫色针状晶体,样品呈紫色针状晶体或蓝紫色粉末状,证实产品中不止含有血红素单体一种物质,可能还含有血红素肽等其他物质。

3 结论

采用最佳的复合酶水解工艺条件从罗非鱼血液中提取血红素,经过酶解、热处理、离心和酸沉淀等技术处理后,血红素提取率达到80.9%,纯度为28.2%。与现有文献报道相比,本文中血红素提取率、纯度均达到较高水平。

紫外-可见光谱扫描和HPLC定性分析发现,产品特征波长为385 nm,产品中的特征成分为血红素,且含量与28.2%一致;超滤定性分析发现,所得产品中约20%的血红素以与大分子肽链结合的形式存在,相对分子量在5～10 ku范围内,而约75%的血红素则可能以单体或者与小分子肽链结合的形式存在,相对分子量小于5 ku;Fe2+和Fe3+含量分析可知,样品中二价铁残留率为37%,因此,在产品生产过程中应该加强二价铁的保护;外观性状观察发现,样品呈紫色针状晶体和蓝紫色粉末状两种形态,证实产

品中不止含有血红素单体一种物质,可能还含有血红素肽等其他物质。相关研究结果为探明产品的功能特性提供了一定的数据支持,具有重要的参考价值。

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Characterization of heme from tilapias blood extracted by protamex hydrolysis

CEN Jian-wei1,HU Qing-rong2,WEI Ya1,YANG Xian-qing1,HUANG Hui1,LI Lai-hao1,*

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences;Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National R&D Center for Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China； 2.Guangdong Shantou Quality and Measuring Supervision Testing Institute,Shantou 515063,China)

Inordertomakethescientificlyandeffectivelyuseoftilapiasbloodresources,aninnovativemethodtoextracthemefromtilapiasbloodwasestablished.Theprocedureconsistsofprotamexhydrolysis,acidprecipitation,vacuumfreezedrying,etc.Theresultsshowedthattheyieldofextractedhemewas80.9%,andthepuritywas28.2%.Thecharacterizationanalysisincludedspectralcharacteristics,molecularweight,Fe2+residualrateandmicroscopicexamination,whichdemonstratedthesample’scharacteristicwavelengthwas385nmandtheprincipalcomponentwasheme. 20%ofthehemewasthecombinationofhemeandmacromolecularpeptidesandthemolecularweightwas5～10ku,but75%ofthehemeprobablywasthemonomerorcombinedwithsmallmolecularpeptides,themolecularweightwaslessthan5ku.TheFe2+residualrateofsamplewas37%,indicatedthatprotectingmeasurewasnecessarywhileextraction.Therelatedresearchresultscouldprovideimportanttheoreticalbasisandtechnicalsupportsforthedevelopmentandapplicationofhemoglobinoftilapiabloodinthefuture.

tilapiasblood;heme;protamex;extraction;characterization

2016-04-01

岑剑伟(1976-)，男，博士，副研究员，研究方向：食品质量与安全，E-mail:genvex@163.com。

*通讯作者:李来好(1963-)，男，博士，二级研究员，研究方向：水产品加工、水产品质量安全与水产标准化等，E-mail:laihaoli@163.com。

中国水产科学研究院基本科研业务费专项(2015B06YQ01)；中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2014YD06)；国家支撑计划项目(2012BAD28B06)；罗非鱼产业技术体系岗位科学家专项经费(CARS-49)；“扬帆计划”引进创新创业团队专项资助(2015YT02H109 )；国家支撑计划项(2015BAD17B03)。

TS254.9

1002-0306(2016)19-0058-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.003