MARCH家族蛋白在免疫、生殖等方面的研究进展*

王美姣 综述,于廷和 审校

(重庆医科大学附属第二医院妇产科重点实验室 400010)



·综 述·

MARCH家族蛋白在免疫、生殖等方面的研究进展*

王美姣 综述,于廷和△审校

(重庆医科大学附属第二医院妇产科重点实验室 400010)

MARCH；E3泛素连接酶；免疫调节；精子

膜相关RING-CH(membrane-associated RING-CH,MARCH)家族是近年发现的一类属于E3泛素连接酶的环指结构域家族，迄今已发现的MARCH家族成员有11种，分别是MARCH1～11。MARCH家族的成员分布广泛，参与多种细胞功能，如免疫调节，蛋白质量控制和膜转运，内质网相关降解，内体蛋白质运输，线粒体动力学平衡和精子发生调控等[1-9]。MARCH家族蛋白相关领域的研究正日益受到重视，因此，本文从MARCH家族蛋白的分类、生物学结构、表达及在免疫、生殖等生物学功能方面就MARCH家族最新研究进展作一综述，旨在为下一步的功能研究和临床研究提供依据。

1 MARCH家族成员的生物学结构

MARCH家族蛋白结构相对保守，大多数MARCH家族蛋白具有类似结构：一个N端的环指结构域，又称RING结构域和零个、两个或多个C端的跨膜结构域(图1)。RING结构域是此家族具有E3泛素连接酶作用的重要因素。E3泛素连接酶的活性依赖于环指结构域，并通过其与E2泛素结合酶相连。这个环指结构域具有特殊的C3HC4结构，由1个3条链组成的β折叠片层、1个α螺旋和两个大环构成。每一环指结构域连有两个锌离子，RING结构域通过与这两个锌离子螯合稳定其结构。MARCH家族的11个成员中有9个成员(MARCH1、MARCH2、MARCH3、MARCH4、MARCH5、MARCH6、MARCH8、MARCH9和MARCH11)含有疏水跨膜结构域，并定位于质膜和细胞器膜。典型的MARCH蛋白特征是2个跨膜域，但MARCH5有4个跨膜域，MARCH6甚至有14个跨膜域，而MARCH7和MARCH10结构特征类似，均不含有跨膜域，其序列同源性仅存在于环指结构域[3,8,10]。MARCH1和MARCH8、MARCH2和MARCH3，以及MARCH4和MARCH9之间高度序列同源，表明这些两两高度同源蛋白具有部分相似功能[1]。

图1 MARCH结构示意图

2 MARCH家族各成员的表达与生物学功能

MARCH家族各成员各具特点和功能，其若干成员还能协同参与多种生理病理功能，见表1。

表1 MARCH各成员概要

2.1 MARCH1、MARCH2、MARCH3、MARCH4、MARCH9和MARCH8及其与免疫功能

2.1.1 MARCH1 MARCH1，又称RNF171，含约289个氨基酸，相对分子质量约为3.2×104，是一种与主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ类分子相关的E3泛素连接酶，主要表达在次级淋巴组织、淋巴结和脾脏的滤泡B细胞上，并高表达于抗原提呈细胞、B细胞和树突细胞(dendritic cells,DCs)，在免疫系统中具有重要的调节作用[11]。MARCH1能泛素化转铁蛋白受体TFRC、CD86(B7-2)、FAS和MHC-Ⅱ类蛋白(如HLA-DRα和β)，并通过多泡体(multivesicular body,MVB)分选到溶酶体，促使其降解[12]。Ohmura-Hoshino等[11]研究表明，在多器官障碍综合征(MODS)病程中，MARCH1可能通过泛素化MHC-Ⅱ类分子来调控其表达水平，进而调控DCs的成熟状态及启动免疫应答反应，从而起着关键性作用，MARCH1可作为一个治疗靶点，以降低MODS临床病死率。MODS病程中MARCH1通过泛素化MHC-Ⅱ类分子来调控其表达并进一步调控DCs抗原提呈作用的具体机制尚需进一步深入研究。Toll作用蛋白(Tollip)会导致MARCH1表达下降而恢复MHC-Ⅱ类分子水平，因此，MARCH1可能是一种新的Tollip靶点。

尽管MARCH1表达仅限于次级淋巴器官[1]，但它能被不同刺激物所诱导或抑制。如白细胞介素10(IL-10)在人初级单核细胞和小鼠B细胞中可调节其表达。MARCH1可作为IL-10诱导的对MHC-Ⅱ抗原呈递途径的免疫抑制效应的调控者。通过反向IL-10诱导MARCH1介导的泛素化和降解，CD83能增加树突状细胞MHC-Ⅱ和CD86(B7-2)。LPS诱导的DCs成熟可抑制MARCH1表达，允许新合成的MHC-Ⅱ类分子在细胞表面表达[12]。

2.1.2 MARCH2和MARCH3 在MARCH家族中，MARCH2和MARCH3是相关度最高的蛋白，有63%的蛋白序列相同[5]，是两个高尔基定位的E3泛素连接酶。MARCH2，含约246个氨基酸，相对分子质量约为2.7×104，广泛表达于各种组织，定位于内质网膜、溶酶体膜和内涵体膜。MARCH2可介导TFRC和CD86(B7.2)的泛素化，并促进其随后的内吞作用和通过MVB分选到溶酶体，从而调节细胞表面β肾上腺素受体的表达[13]。MARCH2能与DLG1相互作用。MARCH2是一种参与胞内转运的突触6结合蛋白[4]。Cheng等[14]报道，MARCH2通过其联合适配蛋白CAL和syntaxin 6(STX6)泛素化并降解CFTR。 MARCH3，含约253个氨基酸，相对分子质量约为2.9×104，定位于早期内涵体膜和多通道膜，可能参与了内涵体运输通路[5]。Koebis等[15]的研究显示，MARCH3在虹鳟鱼低表达，可能参与免疫系统、囊泡运输和蛋白泛素化。

2.1.3 MARCH4和MARCH9 MARCH4，含约410个氨基酸，相对分子质量约为4.6×104，定位于高尔基体膜和多通道膜，可能介导MHC-Ⅰ和CD4的泛素化，并促进其后续内吞作用和通过MVB分选到溶酶体，从而参与免疫系统的调节[1]。MARCH9，又称RNF179，含约346个氨基酸，相对分子质量约为3.8×104，广泛表达于人组织，定位于高尔基体膜、多通道膜和溶酶体膜，可能介导MHC-Ⅰ、CD4和关键细黏附分子ICAM-1的泛素化，并促进其随后的内吞作用和通过MVB分选到溶酶体，从而参与免疫系统的调节[16]。过表达MARCH9导致细胞表面MHC-Ⅰ、CD4和ICAM-1下调。此外，MARCH9仅特异性与HLA-DQ相互作用[17]。

2.1.4 MARCH8 MARCH8，也称C-MIR，含约291个氨基酸，相对分子质量约为3.3×104，广泛表达于各种组织，高表达于肺和胰腺，存在于未成熟树突状细胞，定位于细胞质泡膜、溶酶体膜和早期内涵体膜，能介导CD86(B7-2)、TFRC、FAS和MHC-Ⅱ类蛋白质，如HLA-DP、-DQ和-DR的泛素化，并促进其随后的内吞作用和通过MVB分选到溶酶体。对乳腺癌细胞的研究发现，MARCH8能调控肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)受体的稳态细胞表面表达，是一种肿瘤细胞对TRAIL受体的潜在治疗靶点[18]。MARCH8泛素化降解IL-1受体辅助蛋白(IL1ARP)抑制IL-1β对NF-κB和MAPK的激活，即MARCH8为IL-1β诱导的NF-κB激活途径的特异性抑制剂，为解析天然免疫信号转导的调控机制提供了更多的研究证据，同时也为将来的药物设计提供可能的靶标。Kim等[19]研究发现，MARCH8在斑马鱼卵、斑马鱼和非洲爪蟾的早期胚胎表达，表明其可能在胚胎发育中发挥作用。MARCH8过表达和敲除均导致畸形发育。E-cadherin能被MARCH8泛素化，过表达MARCH8导致E-cadherin降低，表明MARCH8能通过调节E-cadherin的定位来调节细胞黏附强度而对胚胎起作用。因此，适当的MARCH8水平对胚胎生存和细胞黏附维持至关重要。

2.2 MARCH7、MARCH10和MARCH11及其与雄性生殖的关系。

2.2.1 MARCH7 MARCH7，又称Axotrophin，含约690个氨基酸，相对分子质量约为7.8×104，是一种带有单一RING结构域的蛋白质，其重要相似基因是MARCH10。MARCH7的RING结构域与C末端靠近，其N末端为富含丝氨酸/脯氨酸的高度无序结构[10]。MARCH7在脊椎动物中高度保守，尤其在哺乳动物。人类和鼠约85%的氨基酸序列同源，且有一个相同的RING-CH结构域，基因表达谱也相似。最近有研究者对MARCH7在人细胞和组织的表达谱进行筛选，发现MARCH7可在不同类型的人细胞和组织中表达：在人上皮细胞高表达，海马和小脑的神经元和神经元祖细胞、脾血窦内皮细胞、骨髓巨核细胞、小肠隐窝肝细胞和肺泡巨噬细胞中选择性表达，也能在睾丸早期生精细胞、附睾腺上皮表达。Zhao等[7]研究证实，MARCH7在大鼠精子细胞发育的中后期高表达，定位于顶体和鞭毛，可能参与精子头部和鞭毛的形成。Lys48多泛素化链存在于大鼠精子细胞的顶体/acroplaxome、颈部、尾部中段和胞浆，MARCH7介导Lys48多泛素化链进入蛋白酶体被降解。

此外，MARCH7也与神经退行性疾病和免疫耐受相关。MARCH7为正常大脑发育所必需，March7敲除小鼠能存活并具有生育能力，但显示过早神经退行性变和胼胝体的发育缺陷。MARCH7的功能与Foxp3和白血病抑制因子(LIF)相关，在T细胞的增殖、免疫耐受和神经细胞的发育中具有重要作用。Gao等[20]使用MARCH7缺失小鼠，发现其对T淋巴细胞应答具有极大影响，包括了干细胞的细胞因子LIF 8倍过度增殖和5倍过量释放。他们进一步发现：MARCH7是LIF受体亚单位gp190靶向降解所必须的，这就意味着MARCH7在LIF信号调节中起直接作用。Nathan等[10]研究发现，MARCH7趋向于自身泛素化，并与两个去泛素化酶相关-去泛素化酶ubiquitin-specific protease(USP)9X(定位在胞质)和USP7(定位在胞核)。Flach等[21]表明，MARCH7与Tau蛋白相互作用，当体外微管结合受损时，在微管结合区域能单泛素化Tau。

2.2.2 MARCH10 MARCH10，含约808个氨基酸，相对分子质量约为9.0×104，其重要相似基因是MARCH7。Iyengar等[8]研究发现MARCH10定位于大鼠长形精子细胞的主段，是一种精子形成期调控精子细胞鞭毛形成和稳定微管的泛素连接酶。March10基因产物的两种同种型March10a和March10b主要在睾丸表达。MARCH10a与MARCH10b的功能不同：March10a编码一种具有泛素连接酶活性的长环指蛋白，是一种微管相关蛋白，在微管结构中发挥作用；而March10b定位于胞质，编码一种缺少环指结构域的短富含脯氨酸的蛋白质，即MARCH10b缺少泛素连接酶活性。MARCH10b在C末端区富含脯氨酸序列，表明其介导蛋白质与蛋白质相互作用，例如，与Src同源3、WW和EVH1域发生相互作用，因此，MARCH10b可充当适配器或支架蛋白的作用。

2.2.3 MARCH11 MARCH11含约402个氨基酸，相对分子质量约为4.4×104，高表达于睾丸，可能在精子形成期和精子鞭毛形成中发挥重要作用[9]。MARCH11主要表达于发育中的精子细胞，在脑和垂体也有少量表达，定位于胞质泡膜、早期内涵体膜。在早期圆形精子细胞中，MARCH11定位于反面高尔基体管网状结构(TGN)和MVB，能泛素化精子形成期相关多拷贝跨膜(SAMT)蛋白，使其传递到晚期胞内体/溶酶体区室。SAMT家族蛋白是MARCH11的底物，MARCH11在小鼠精子细胞通过泛素连接酶活性将其经TGN-MVB通路递送至溶酶体，可能参与哺乳动物精子发生[9,22]。此外，CD4是MARCH11的另一底物[9]。

2.3 MARCH5及其与线粒体相关 MARCH5，是一种线粒体泛素连接酶，又称MITOL，含约273个氨基酸，相对分子质量约为3.1×104。MITOL拥有一个负责泛素连接酶活性的植物同源域(PHD)基序和4个跨膜域，可在脑、心脏、肝、肺、脾、胃、睾丸、骨和肌肉表达，定位于线粒体外膜和内质网膜，能分别通过降解线粒体分裂蛋白hFis1和Drp1、线粒体融合蛋白mitofusin1(Mfn1)和mitofusin2(Mfn2),以及微管相关蛋白1B(MAP1B)而对包括线粒体形态、运输、与内质网的相互作用等线粒体动力学起关键性作用[6]。MARCH5作为Mfn1上游调控者，通过调控乙酰化Mfn1，阻止在应激状态下过量Mfn1集聚，对维持线粒体稳态和细胞存活至关重要。MARCH5沉默细胞会表现出线粒体形态畸形。MARCH5缺失可导致线粒体伸长，通过阻断Drp1活性和(或)促进Mfn1在线粒体的积聚而诱导细胞衰老，因此，MARCH5作为线粒体质量控制的调节器，可能在预防细胞衰老中发挥作用[23]。Yonashiro等[24]证实MITOL能阻断S-亚硝基MAP1B-轻链1(LC1)介导的线粒体功能障碍与神经元细胞死亡。MARCH5能与线粒体的Mfn2相互作用，但不能与内质网的Mfn2相互作用。Mfn2的GTP酶域的K192是MARCH5主要的泛素化位点，MITOL通过使该位点泛素化来激活Mfn2，从而调控内质网-线粒体的相互作用。由此推测MARCH5可能通过调控Mfn2而参与神经退行性疾病的发病机制。MITOL泛素化SOD1突变体并减少SOD1突变所致活性氧产生，从而对线粒体起保护作用。MITOL能直接泛素化，并通过泛素-蛋白酶体通路促进线粒体多聚谷氨酰胺polyQ的降解，从而控制polyQ聚集体形成和细胞毒性，由此推测MITOL可以作为治疗polyQ疾病的潜在靶点。

2.4 MARCH6及其与降脂相关 内质网E3泛素连接酶MARCH6，又称酿酒酵母Doa10或在人也称TEB4，含约910个氨基酸，相对分子抟量约为1.03×104，定位于内质网膜和多通道膜，参与内质网相关蛋白的降解。Doa10能通过RING结构域与泛素结合酶Ubc7相互作用，调控E2的降解。Doa10/Teb4能通过调控角鲨烯单加氧酶(SM)的降解，以达到甾醇体内平衡。研究发现Erg1(SM的同源物)是酵母中Doa10的底物，Doa10依赖Erg1的降解受羊毛甾醇所调控，高水平的lanosterol促使Erg1的降解。但在哺乳动物细胞中，是胆固醇刺激TEB4介导的SM降解，影响3-羟基-3-甲基戊二辅酶A还原酶和胆固醇合成途径，从而为TEB4靶向治疗高脂血症提供了可能[3]。

3 展 望

MARCH家族作为E3泛素连接酶新近发现的一类，在调节许多生物过程中起着重要作用，其异常表达会导致某些疾病(如免疫功能异常、雄性不育、线粒体功能异常、高脂血症等)的发生。MARCH家族决定了泛素-蛋白酶体通路底物的特异性，因此，高通量识别底物将是今后研究的主要方向。随着MARCH家族蛋白相关领域研究的不断深入，其关键性的新功能不断被发现，其重要性将日益受到更为广泛的关注。总之，深入研究MARCH家族，无论对于相关疾病发病机制的研究，还是对于这些疾病临床治疗和药物的开发皆具有重要意义。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.039

国家自然科学基金资助项目(81300535)；重庆市科委自然科学基金资助项目(cstc2013jcyjA10075)。 作者简介：王美姣(1983-)，医师，硕士，主要从事生殖医学与生殖生物学研究。△

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1671-8348(2016)29-4144-04

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