瓜蒌根抗氧化活性物质的提取及其活性评价

李婉珍，杨 成，朱龙宝，魏胜华

(1.安徽工程大学 微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽 芜湖 241000；2.皖南医学院 基础医学院,安徽 芜湖 241000)



瓜蒌根抗氧化活性物质的提取及其活性评价

李婉珍1，杨 成2，朱龙宝1，魏胜华1

(1.安徽工程大学 微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽 芜湖 241000；2.皖南医学院 基础医学院,安徽 芜湖 241000)

以对1,1-苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)的清除率为指标，研究了甲醇浓度、料液比、提取温度及提取时间对瓜蒌根抗氧化活性成分提取效果的影响.结果表明，最佳提取条件为甲醇浓度65%、料液比1∶5、提取温度60 ℃、提取时间70 min；在此条件下，相对自由基清除率由58.6%升高到78.1%，提高了近20%；同时建立了D-半乳糖衰老模型，对模型小鼠血浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量进行检查，考察其体内抗氧化效应.通过高剂量瓜蒌根提取物灌胃能够显著地提高衰老模型小鼠血浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低丙二醛(MDA)含量，相比模型对照组SOD活力提高了38.966 U/mL，MDA含量降低了2.853 nmol/mL，表明瓜蒌根提取物具有较好的抗氧化活性.

瓜蒌根；提取工艺；优化；抗氧化活性

研究发现，作为机体正常代谢产物的自由基与人类很多疾病有关[1-2].自由基清除剂可以减少自由基，起到减缓因自由基过多造成的氧化损伤作用，对延缓机体衰老具有一定的积极效应[3].目前发现多种中药提取物具有抗氧化作用，从中药中寻找高效、价廉、低毒甚至无毒的抗氧化剂倍受关注[3].

瓜蒌(TrichosanthesKirilowii Maxim)属葫芦科多年生草本植物，是常用的中草药之一.瓜蒌根(又名天花粉)，其主要成分为蛋白质、淀粉、多糖及皂苷等，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功效.皂苷广泛分布于多种陆生植物，可抑制过氧化脂质生成，具有抗衰老作用，但对其抗氧化活性的研究较少[4-5].研究以体外抗氧化活性为指标提取瓜蒌根抗氧化活性物质，并采用与体内抗氧化评价相结合的方法，研究瓜蒌根的抗氧化活性，以便为深入应用瓜蒌提供有力的实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

瓜蒌由安徽省金寨县惠农瓜蒌专业合作社提供，将其粉碎并过80目筛备用;DPPH自由基(Sigma公司)；高纯D-半乳糖(合肥博美生物有限公司)；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)试剂盒、丙二醛(Maleic Dialdehyde, MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；甲醇等均为国产分析纯;实验小鼠18～25 g，雌雄各半，皖南医学院动物房提供.

1.2 主要仪器设备

低速离心机(TD5Z型，上海安亭科学仪器厂)；超声波振荡仪(DFS-200G型，海析生超声仪器有限公司)；电子天平(FC104型，上海精密科学仪器公司)；高速粉碎机(FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9076A型，上海精宏实验设备有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52CS型，上海亚荣仪器设备有限公司)；酶标仪(EPOCH型，美国Biotek公司).

1.3 瓜蒌根抗氧化活性物质提取工艺优化

(1)超声波辅助提取工艺流程.瓜蒌根→干燥→粉碎→过80目筛→超声波提取→离心→活性测定.

(2)单因素实验.称取瓜蒌根干粉1 g，按料液比1∶10(g/mL)，采用浓度为55%甲醇作为提取溶剂，提取温度50 ℃，超声波提取10 min，作为单因素筛选实验的基础条件.研究甲醇浓度、料液比、提取温度、提取时间中的某一因素时，其他条件保持不变，单因素实验水平设计如表1所示.

表1 单因素实验水平设计

(3)瓜蒌根抗氧化活性物质超声提取工艺优化.依据文献[6-7]中2.1体外抗氧化单因素实验分析结果，以自由基清除率为指标、甲醇为提取剂，采用正交试验法对其提取工艺进行优化，分别确定最佳提取剂浓度、料液比、温度及时间4个因素，每个实验因素设计3个水平正交实验如表2所示.

表2 试验因子及水平L9(34)

(4)瓜蒌根抗氧化活性物质体外自由基清除活性.体外自由基清除活性测定方法参照文献[8-9].计算方法可以表示为：

1.4 瓜蒌根提取物体内抗氧化活性测定

(1)动物造模.参照文献[10]，将实验小鼠随机分为6组，每组6只，设阳性对照组(0.1% VC)、正常对照组、模型对照组及药物组.除正常组皮下注射生理盐水外，其余5组每天125 mg/kg皮下注射D-半乳糖造模，同时对药物组按剂量90 mg/kg、60 mg/kg、10 mg/kg进行灌胃给药，阳性对照给予等量的VC，正常、模型对照灌胃等量水，连续灌胃21 d.眼球取血，肝素抗凝离心，弃沉淀留血浆冷藏待用.

(2)小鼠血浆中SOD活力和MDA含量的测定.取上述冷藏血浆，按试剂盒内说明书指示进行SOD活力和MDA含量测试.

1.5 数据统计分析

2 实验结果及分析

2.1 单因素实验结果与分析

(1)甲醇浓度对提取物抗氧化活性的影响.采用甲醇提取活性成分，研究不同浓度甲醇对清除自由基效果的影响，结果如图1所示.由图1可知，自由基清除率与甲醇浓度关系呈类似正态分布效果，随甲醇浓度增加自由基清除率上升，当甲醇浓度达到65%时，清除率达到最高值即74.55%，而后反而下降.可能是由于瓜蒌根主要成分为蛋白质，当遇到醇时，随醇浓度增加变性的蛋白质可能阻碍了有效活性物质的释放，从而出现随醇浓度增加，清除自由基活性呈现先高后低的结果[11].

(2)料液比对提取物抗氧化活性的影响.对料液比的选择，溶剂不能太少，否则黏度大，过滤或离心困难；也不易太多，否则不利于后期浓缩.因此，根据实验室经验进行1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25比较实验，结果如图2所示.由图2可知，随着料液比的增加，自由基清除率逐渐降低，说明可能料液比大并不有利于自由基清除活性物质渗出，因而实验采用1∶5的料液比为宜.

(3)提取温度对提取物抗氧化活性的影响.实验温度过高会影响目标物的稳定性，所以采用30～70 ℃进行提取，结果如图3所示.由图3可知，随着提取温度的升高，瓜蒌根活性成分的自由基清除率也随之升高.结果显示活性物质在30～70 ℃温度范围内比较稳定，在70 ℃温度条件下自由基清除率最高，可能是由于在此温度条件下其他提取物如肽、蛋白质等物质变性而以沉积形式析出，减少了干扰，从而提高了清除率；也可能其中的皂苷活性组分进一步被分解成其他中间活性产物[12]，因此选择70 ℃作为瓜楼根活性成分中自由基清除剂的提取温度.

(4)超声波时间对提取物抗氧化活性的影响.超声波辅助提取具有省时、节能、提高提取率等优点，其对提取物抗氧化活性的影响如图4所示.由图4可知，当样品浓度一定时，随着超声波提取时间的延长，自由基清除率呈现先高后低的趋势.这可能是因为时间越长活性成分提取越完全，但同时杂质渗出也在增加，且时间太长提取物中抗氧化活性成分也可能被空气氧化，因此，超声提取时间以60 min为宜.

图1 甲醇浓度对提取物抗氧化活性的影响 图2 料液比对提取物抗氧化活性的影响

图3 提取温度对提取物抗氧化活性的影响 图4 超声波时间对提取物抗氧化活性的影响

2.2 超声提取优化工艺

在单因素实验基础上，经正交实验分析如表3所示.由表3可知，极差最大的为主要影响因素，较小的为次要因素，各因素对指标的影响程度为D>B>A>C，即提取时间>料液比>甲醇浓度>提取温度，超声波时间的影响最大，其次是料液比和甲醇浓度，提取温度影响最小.方差分析如表4所示.由表4可进一步看出各因子对自由基清除剂生成的影响，在95%的置信度下，B、D对指标的影响均为显著.综合分析结果，实验最佳组合为A2B1C2D3，即提取工艺为甲醇浓度65%、料液比1∶5、提取温度60 ℃、提取时间70 min.

表3 正交实验分析表

表4 方差分析表

2.3 瓜蒌根提取物对小鼠血浆SOD活性和MDA含量的影响

提取物对衰老小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响如表5所示.由表5可知，小鼠血浆中SOD活性和MDA含量在组与组间有很显著的差异，具有统计学意义(P<0.01).针对血浆SOD活性，与正常组比较，阳性对照组差异显著(P<0.05)，模型组差异极显著(P<0.01)，说明模型可用；与模型组比较，阳性对照组和药物高剂量组均存在显著差异(P<0.05)，与阳性对照组比较，药物高剂量给药，在SOD活性方面差异不显著，无统计学意义(P>0.05)，说明药物高剂量供试提取物可显著提高小鼠血浆SOD活性.针对MDA含量，与模型相比，正常组、阳性对照组和不同剂量药物组均差异显著(P<0.05)，表明在该浓度条件下，供试药物都能降低MDA含量，药物组间无差异(P>0.05).

表5 提取物对衰老小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响±s，n=6)

3 结论

通过正交优化实验可知，影响瓜蒌根抗氧化活性成分超声辅助提取的主次因素为提取时间、料液比、甲醇浓度和提取温度，且影响顺序依次为提取时间>料液比>甲醇浓度>提取温度；确定最佳提取工艺条件为甲醇浓度65%、料液比1∶5、提取温度60 ℃、提取时间70 min.此条件下活性提取物对体外DPPH相对清除率达到78.18%；体内抗氧化实验表明，瓜蒌根提取物在较高剂量下具有抗氧化活性，提高血浆中SOD活力，降低MDA含量.实验只对瓜蒌根抗氧化活性在提取过程中的影响因素进行了研究，其他方面还有待进一步完善.

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Antioxidant Components Extraction from Trichosanthes Root and Activity Evaluation

LI Wan-zhen1,YANG Cheng2,ZHU Long-bao1,WEI Sheng-hua1

(1.Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000, China;2.College of Basic Medical Sciences,Wannan Medical College,Wuhu 241000, China)

Based on the capacity of scavenging DPPH free radical of bio-active ingredients fromtrichosanthesroot,the effect of methanol concentration,solid-liquid ratio,extraction temperature and extraction time on the extraction process were to be optimizd.The result showed that the free radical scavenging rate increased by 20%,rangin from 58.6% to 78.1% under the condition of 65% methanol,1∶5 ratio of material to solvent 70 min and 60 ℃. At the same time,the aging model of D-galactose was established to investigate the anti-oxidation activity through detecting the activity of SOD and the and contents of malondiadehyde (MDA) of mouse plasma.The result showed that the activity of SOD was enhanced by 38.966 U/mL,and the content of MDA was lowered 2.853 nmol/mL and thattrichosanthesroot extract has good antioxidant activity.

trichosanthesroot;extraction process;optimization;anti-oxidant activity

1672-2477(2016)05-0063-05

安徽省高校自然科学基金资助项目(KJ2013B027)

李婉珍(1979-)，女，安徽六安人，讲师，博士研究生．

Q946

A