牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠组织NOSmRNA表达的影响

孟 宇，吕 俊，凌烈峰，高家林

(1.皖南医学院 生物化学研究室，安徽 芜湖241002；2.活性生物大分子研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002)



牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠组织NOSmRNA表达的影响

孟 宇1，2，吕 俊1，2，凌烈峰1，2，高家林2

(1.皖南医学院 生物化学研究室，安徽 芜湖241002；2.活性生物大分子研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002)

目的:探讨牛蒡低聚果糖对大鼠动脉性勃起功能障碍(A-ED)治疗作用的机理.方法:利用RT-PCR方法检测经灌胃给药后的A-ED大鼠阴茎组织和睾丸组织中三种亚型NOSmRNA的表达．结果：牛蒡低聚果糖10g/kg和20g/kg能提高A-ED大鼠阴茎组织神经型一氧化氮合酶(nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的表达水平；牛蒡低聚果糖10g/kg和20g/kg灌胃后,与模型组比较,能增加睾丸组织中nNOS和eNOS基因表达(P<0.01)．结论:牛蒡低聚果糖能显著上调nNOS和eNOS基因的表达,使得NO的合成增加，从而影响大鼠的勃起功能．

牛蒡低聚果糖；A-ED大鼠；NOS基因表达

勃起功能障碍(erectile eysfunction，ED)近年发病有所增加，动脉性ED(A-ED)是血管性ED的一种,也是常见的ED，治疗现状不是很乐观，药物短暂缓解病情，并不能从根本上治疗ED病．NOS(一氧化氮合酶)在ED病的发生和发展中起着重要作用，本实验通过检测牛蒡根化学成分牛蒡低聚果糖对动脉性ED大鼠阴茎组织和睾丸组织中三种亚型NOSmRNA表达的变化，从而进一步探索其治疗ED病的可能机制．

1 材料

1.1 实验动物

SD大鼠全部雄性32只，成熟，体重在180g左右，由皖南医学院动物房提供，分笼饲养，保证笼内卫生，温度稳定在25℃，自由取水、饮食．

1.2 药品和试剂

牛蒡低聚果糖由南京凯基生物有限公司购买；Trizol总RNA提取试剂，合肥志宏生物有限公司购买，RT-PCR试剂盒，合肥志宏生物有限公司购买．

2 实验方法

2.1 分组和模型的建立

将32只雄性SD大鼠，随机分成4组：假手术组(给予等量的蒸馏水)；模型组；牛蒡根低聚果糖10g/kg组、20g/kg组．髂内动脉结扎处理模型组及给药组，用0.4%的戊巴比妥钠腹腔注射大鼠进行麻醉后，正中切开下腹部皮肤、皮下组织，剪开腹膜后进入腹腔，在髂总动脉分叉处找到左髂总动脉，深处找到左髂内动脉，在其起始处用线结扎左右髂内动脉．假手术组打开腹腔后，即缝合腹部不做髂内动脉结扎．造模后每天给药一次，连续给药28天．

2.2 RNA的提取

取出模型组和给药组的阴茎组织和睾丸组织各100mg，液氮罐中磨碎成粉末，用Trizol一步提取法提取细胞总RNA，操作按照试剂盒说明书进行．

2.3 RNA浓度和纯度的测定

取RNA样品用缓冲液稀释样品100倍，测定样品在260nm和280nm的吸收值来确定RNA的质量．按公式计算：RNA的浓度=OD260×稀释倍数×0.04μg/μL，OD260/280在1.8～2.1视为RNA纯度高．

2.4 逆转录实验

按要求在经过灭菌和无核糖核酸酶处理的PCR管中加入RNA、Oligo dT(18)、RNase抑制剂、Buffer2.5μL、dNTPs、DTT(1M)、逆转录酶(AMV)，无核酸酶的双蒸水等反应所需物质后，经过离心，保温、冰浴等步骤后，得到产物，-20℃进行保存．

2.5 逆转录产物的扩增

取上步产物在PCR扩增仪器上进行扩增，以β-actin为内参照物．取逆转录产物2μL，加入25μL反应体系．β-actin反应及三种亚型NOS的反应均经过预变性95℃ 5s，95℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸35s，30个循环；72℃延伸10s；反应完成后，取反应产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳以确定产物是否为扩增产物．最后对反应结果进行吸光度(A)扫描，用目的基因β-actin的相对面积灰度值来表示其结果．

3 实验结果

3.1 牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠阴茎组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响

牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠阴茎组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响结果见图1、表1，由表1可知，牛蒡低聚果糖10g/kg和20g/kg能明显提高A-ED大鼠阴茎组织nNOS和eNOS基因表达水平，牛蒡低聚果糖20g/kg能够显著提高nNOS和eNOS基因表达；其凝胶电泳图，如图1所示.

表1 牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠阴茎组织中3种NOS亚型基因表达的影响

注：模型组与假手术组比较△p<0.05,△△p<0.01；给药组与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01

3.2 牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠睾组丸组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响

牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠睾丸组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响结果，如表2所示，由表2可知，经牛蒡低聚果糖10g/kg和20g/kg灌胃后，与模型组比较，能明显增加nNOS、eNOS基因表达(P<0.05)．其电泳图，如图1所示.

表2 牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠睾丸组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响±s)

注：模型组与假手术组比较△p<0.05,△△p<0.01；给药组与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01

图1 牛蒡低聚果糖对A-ED大鼠睾丸和阴茎组织三种亚型NOS基因表达电泳图

1.模型组睾丸组织；2.模型组阴茎组织；3.假手术组睾丸组织；4.假手术组阴茎组织；5.牛蒡低聚果糖10g/kg组睾丸组织；6.牛蒡低聚果糖20g/kg组睾丸组织；7.牛蒡低聚果糖10g/kg阴茎组织；8.牛蒡低聚果糖20g/kg阴茎组织

4 讨论

关于阴茎勃起机制的研究，L-Arg-NO-cGMP信号通路这个机制已经被大家所认可．作为合成NOS的关键酶，NOS在阴茎勃起的起始阶段具有重要作用．NOS包括神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)三种类型．NOS主要分布在阴茎海绵体的神经以及平滑肌上，它在介导阴茎平滑肌松弛过程中起着关键作用，NO作为一种神经递质在平滑肌松弛的信号传导通路中发挥重要作用．研究阴茎组织和睾丸组织中信号分子NO的含量，对勃起功能障碍的病理生理学以及开发治疗勃起功能障碍新药物具有重要意义．血管性ED是常见类型．动脉性ED是血管性ED的一种，阴茎动脉供血不足，是ED病发生的最常见原因之一．国外学者采用结扎双侧髂内动脉的方法建立了A-ED模型．缺血缺氧后导致固有型NO产生减少，使信号传导功能降低，从而导致阴茎海绵体舒张功能降低．通过大鼠双侧髂内动脉结扎建立了动脉性ED模型，动脉性ED模型组三个NOS亚型的mRNA表达明显降低，说明该模型可以作为缺血性ED研究的模型．也提示双侧髂内动脉结扎除了引起海绵体结构和功能损伤外，降低NOS的表达，影响NO-cGMP信号通路功能可能是A-ED的发病机制．

前期实验已经证明牛蒡低聚果糖能够改善ED症状，但机制并不是很明确．本实验经过28天的不同剂量的牛蒡低聚果糖灌胃给药后，RT-PCR实验结果表明牛蒡低聚果糖显著上调nNOS和eNOS基因的表达，从而使得NO的合成增加．进而影响NO-cGMP通路，介导平滑肌松弛，促使阴茎勃起，来改善勃起功能障碍．

由此可见，牛蒡根化学成分牛蒡低聚果糖促使NOS表达的增加可能是改善A-ED大鼠的勃起功能的主要机制，后期实验将继续研究．

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(责任编辑:陈衍峰)

10.13877/j.cnki.cn22-1284.2016.08.021

2015-10-12

国家自然科学基金“溶酶体膜蛋白sidt2对胰岛素颗粒分泌的影响的作用机制研究”(81200632)；安徽省自然科学基金“探索溶酶体膜蛋白sidt2 在胰岛素分泌过程中的作用机制”(1308085QH134)；活性生物大分子研究安徽省级重点实验室项目(LAB201401)

孟宇,女,安徽临泉人,教师.

Q95-3

A

1008-7974(2016)04-0063-03