电针对脑梗死大鼠缺血区BDNF及CREB表达影响的研究*

王东岩,孙 艳,董 旭,李 影,李 铁

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)



电针对脑梗死大鼠缺血区BDNF及CREB表达影响的研究*

王东岩1,2,孙 艳1△,董 旭1,2,李 影1,李 铁1

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的：通过观察电针刺激“前三里穴”和“外关穴”，探讨电针治疗脑梗死的作用机制。方法：将健康雄性SPF级SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组和电针组。应用线栓法制备大鼠局造性脑梗死模型。分别在1、3、7、14、21天用网屏实验评分法对各组大鼠神经功能缺损情况进行评定；各组大鼠在治疗结束后取材。采用免疫组织化学方法观察脑源性神经营养因子(BDNF)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)在大鼠缺血区的阳性表达。结果：空白组、假手术组网评实验评分为0，术后1天评分最高，术后21天评分最低，术后各时间点，模型组与空白组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。术后3、7天，电针组与空白组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，电针组与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。术后14、21天，电针组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，电针组与空白组对比，差异无统计学意义(P>0.05)。造模后脑内BDNF表达水平显著下降，电针治疗后BDNF表达上升。空白组与假手术组差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、电针组与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；电针与模型组比较，差异显著(P<0.05)。造模后脑内CREB表达水平显著下降，电针治疗后CREB表达上升。空白组与假手术组对比，差异无统计学意义(P>0.05)；电针组、模型组与空白组对比，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组与模型组对比，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：电针可以改善脑梗死后运动功能障碍并上调BDNF、CREB的表达。电针干预对脑梗死具有神经保护作用，其机制可能与其缺血区周围BDNF、CREB阳性表达水平上调有关。

脑梗死;电针;BDNF;CREB

脑梗死，也称缺血性脑卒中，近年来其发病率逐年上升，且复发率高、致残率高、死亡率高，患者日常生活活动明显受限，为家庭和社会带来沉重影响。因此，对本病的治疗已成为研究热点。电针治疗脑梗死的疗效已得到世界范围的认可。大量研究证实,电针对脑梗死有明确的治疗作用,是治疗脑梗死后运动功能障碍的有效方法。但电针治疗脑梗死的作用机制还有待于进一步的研究。脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)是体内含量最多的神经营养因子，环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)可通过增加脑源性神经营养因子基因的表达，促进神经细胞的存活，增加突触可塑性和神经发生。本实验的目的是研究电针治疗脑梗死的作用机制，本课题在制备大鼠大脑中动脉梗死模型基础上，采用神经行为学评估、免疫组织化学技术方法，观察电针对脑梗死大鼠前肢运动功能障碍的恢复情况以及缺血区周围皮质BDNF、CREB的表达情况。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

BDNF、CREB羊抗兔多克隆抗体由北京博奥拓达公司提供，PV6001、DAB由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，其它试剂为国产分析纯。

1.2 实验动物与分组

健康雄性SPF级SD大鼠60只，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供,动物使用许可证：SYXX(黑)2010007，鼠龄4～5个月，体质量(250±20)g，随机分为空白组10只、假手术组10只、模型组20只、电针组20只。通过阻闭大鼠大脑中动脉法，诱导局灶性脑缺血模型。术前12h 大鼠禁食不禁水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml/kg)，待麻醉后，仰卧位固定于操作台，剪除颈部施术取毛发，消毒，在两侧下颌骨连线中点，颈部正中旁开0.5cm，做长约1～2cm切口，逐层剥离筋膜和肌层，轻轻撕裂动脉鞘，暴露并钝性分离CCA、ECA及ICA，距离分叉处远端结扎CCA，距离分叉处近端结扎ECA，动脉夹夹闭CCA分叉处下方，在动脉夹下方用眼科剪斜45°剪一小切口，栓线缓慢插入，固定栓线，去掉动脉夹，使栓线进入ICA17～18mm，再次固定栓线，剪掉多余栓线(剪除过程中注意防止栓线脱落)及结扎线。冲洗伤口后缝合组织皮肤，再次消毒。术后动物置于清洁干燥鼠笼内，白炽灯加热保暖。

1.3 电针治疗方案

参照华兴邦等制定的《实验动物腧穴图谱》[1]选取前三里穴、外关穴，直刺1mm。连接频率刺激器，50Hz，连续波，每次20min，每日1次,21天。在电针组治疗同时空白组、假手术组和模型组进行绑缚处理。

1.4 网屏实验

实验上放置海绵，距地面80cm，屏幕水平放置，将大鼠放在中央，然后慢慢地将其一端抬高，2s将屏幕到垂直位置，保持5s进行观察。评分标准：0分：保持5s，不落；1：暂时保持，滑动一段距离，但不落；2：5s内落下；3分：网屏转动时，大鼠立刻掉下来[2]。

1.5 取材检测

各组大鼠治疗结束后腹腔麻醉，4℃生理盐水经心脏灌注，待两肺变白后，灌注4℃4%多聚甲醛。灌注成功后，取出脑组织后迅速剥离缺血区，原液固定5h，脱水、包埋、切片，采用PV二步法检测BDNF、CREB表达情况，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，以积分光密度(IOD)代表基因和蛋白相对表达量，积分光密度(IOD)=阳性面积×平均光密度，每组每例随机分析3个高倍镜视野倍，取其均值代表该照片的相对表达量。染色结果细胞核呈蓝色，阳性为黄色或黄棕色。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 电针对MCAO模型大鼠行为学影响

空白组、假手术组网评实验评分为0，术后1天评分最高，术后21天评分最低，术后各时间点模型组与空白组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。随着脑缺血时间的延长，模型组评分逐渐降低，说明大鼠脑缺血后有一定的自愈性。术后1天，电针组与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。术后3、7天，电针组与空白组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，电针组与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。术后14、21天，电针组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，电针组与空白组对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 脑梗死大鼠神经功能缺损

2.2 电针对MCAO大鼠缺血皮层BDNF、CREB阳性表达情况

造模后脑内BDNF、CREB表达水平显著下降，电针治疗后BDNF、CREB表达上升。空白组与假手术组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、电针组与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；电针与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠缺血区周围皮质BDNF、CREB积分光密度比较

3 讨论

脑梗死主要原因是脑组织局部血供动脉的突然减少或闭塞，以至于该血管供血区的脑组织缺血、缺氧，致使脑组织软化、坏死，相应的症状和体征，如昏迷、偏瘫、失语等神经功能缺损均与相应的血管相关。脑卒中是目前导致人类死亡的三大疾病之一，具有高发病率、高致残率的特点。近年来，脑梗死发病有逐年增多的趋势。尽管通过物理疗法、口服或静点中药、西药等多种方法进行治疗，在较大程度上降低了本病的致死率，但致残率一直居高不降。脑梗死病人往往存在不同程度的意识障碍、运动功能障碍、感觉障碍、认知障碍、语言障碍等问题。其中，约有75%的病人遗留不同程度的上肢功能障碍，严重影响了患者的日常生活活动能力，降低了患者的生活质量[3]。电针治疗脑梗死的实验研究中，电针对缺血脑组织的保护作用明显。大量的科学研究已经证明，针灸在脑梗死发展的各个方面发挥了逆转疾病的作用[4]。目前，针灸治疗脑梗死的机制尚未明确。大量的研究证实，针灸具有多靶向功能，可以通过调节多条通路使脑梗死后功能障碍的到改善。

BDNF归属于神经营养因子家族(为第二位重要因子)。在所有神经营养因子成员中，BDNF的活性作用最强，它通过神经轴突逆行运输至神经元胞体，与特异的神经元受体结合发挥相应的生理功能[5]。而且BDNF在脊椎动物中枢及周围神经系统发育中作用广泛[6]，它能促进许多神经元发挥生理作用(生存、发育、分化、再生等)，维持神经细胞代谢功能,并对增强中枢及周围神经的营养、支持、保护及功能表达发挥重要作用[7]。CREB是碱性区域亮氨酸拉链蛋白家族的一个成员，它是一种高选择性结合cAMP反应元件的核蛋白。BDNF通过与TrkB的结合而发挥作用。TrkB的胞内区域具有内在的酪氨酸激酶活性，BDNF与TrkB结合后激活胞内区域，在CREB的丝氨酸位点激活CREB，使其磷酸化。磷酸化的CREB通过增加BDNF基因的表达，来促进神经细胞生存，为脑缺血保护机制之一[8]。本研究表明，脑梗死后BDNF、CREB表达显著下降，而电针治疗可以改善脑梗死大鼠运动功能，上调BDNF、CREB的阳性表达水平，进一步证明电针干预对脑梗死具有神经保护作用，其机制可能与其缺血区周围BDNF、CREB阳性表达水平上调有关。

[1] 华兴邦,周浩良.大鼠穴位图谱的研制[J].动物与动物实验,1991(1):1-5

[2] Rivlin AS,And CH,Tator.Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in the rat[J].Neurosurg,1977,47(4):577-81

[3] 陈健安.董氏奇穴治疗中风后上肢痉挛性偏瘫的临床观察[D].广州:南方医科大学,2015

[4] 慎宰莹.应用功能磁共振成像(fMRI)对头针治疗中风偏瘫后脑功能重塑机制研究[D].北京:北京中医药大学,2013

[5] Jia Y,Lynch GG.Presynaptic BDNF Promotes Postsynaptic Long-Term Potentiation in the Dorsal Striatum[J].Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience,2010,30(43):14440-14445

[6] Binder DK.The role of BDNF in epilepsy and other diseases of the mature nervous system[J].Advances in Experimental Medicine & Biology,2004,548(548):34-56

[7] Binder DK.Brain-Derived Neurotrophic Factor[J].Growth Factors,2004,22(3):123-31

[8] 江东,于建云.脑源性神经营养因子临床研究进展[J].神经解剖学杂志,2011(2):221-225

国家自然科学基金，编号:81473763。

王东岩(1971-)，女，教授，博士研究生导师，从事神经功能障碍的针灸康复治疗与评价方面的研究。

△通讯作者：孙艳(1992-)，女，2013级针灸推拿学专业硕士研究生。

R246.6

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1005-0779(2016)10-0084-03

2016-05-01