突触体制备方法研究

周荣易， 王娇娇综述， 韩新民审校



突触体制备方法研究

周荣易， 王娇娇综述， 韩新民审校

突触(synapse)，即是指一个神经元与另一个神经元相接触的部位，突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。由于其特殊位置和作用，突触是探讨脑功能的关键所在[1]。在现代神经生物学及众多其他学科的研究中，突触的作用日益得到重视。从中枢神经系统中分离出形态完整，活性较高的突触体是进行离体神经生理、生化和药理研究的前提。但国内相关制备技术却鲜有报道。国外突触体制备技术从发明至今已从最初的不连续性蔗糖密度梯度法发展到随后的改进方法及Ficoll/sucrose法直至现在的不连续性Percoll密度梯度离心法，其方法不断改进，技术不断革新，为现代神经生物学研究提供了保障。通过查阅搜集大量国内外相关文献，总结国外突触体制备技术，介绍国外突触体制备技术的发展和先进技术的应用，以备参考。

1 突触体

突触体(synaptosome)，这一专有名称最早是于1964年由Whittaker和他的团队提出，并被他们通过离心方法提取出来[2]。突触体是指具有突触区完整形态结构的封闭颗粒，实际上它是断裂脱落的神经末梢或突触连接区，从某种意义上讲，它可以被认为是一个具有功能完整的活细胞[3]，突触体之所以能被离体制备，根本在于其突触间连接的牢固性和突触裂口区的自动融合性，这些特性能够使断裂的神经末梢完整保存突触区的各种成分及其功能，保留着活细胞的一系列特性[3]。这就使得突触体的分离和离体实验变得可能且具有研究价值。自20世纪60年代突触体分离成功，突触体分离技术促进了神经生物学的快速发展，离体突触生理、生化及药理研究等大大促进了人们对神经系统疾病的认知。研究报道，海马神经元突触体的损伤与数量的减少与老年人的记忆力减退密切相关[4，5]。另有相关报道证实突触体的受损与减少同样会导致小鼠的学习能力和记忆能力下降[6]。因此，制备结构完整、高活性的突触体是进行神经生物学研究的前提。

2 制备方法

从20世纪60年代突触体分离成功至今，突触体的分离和纯化方法得到了不断的改进，所提取的突触体形态结构保存不断完整；生理活性不断提高；同时，随着方法的不断完善和革新，提取率也有所上升。突触体为生物化学和药理学对神经末梢的研究和神经递质传导体外研究提供了良好的研究对象[7]。现代神经生物学研究中，制备形态结构完整、具有生理活性和较高产出率的突触体，是进行神经生物学进一步分析研究的基础。从突触体命名至今，突触体的制备与纯化和其他亚细胞结构的提取和纯化方法大致相同，主要可分为不连续性蔗糖密度梯度离心法(蔗糖法)[2，8]、经典方法的改进型方法[9]、和不连续性Percoll 密度梯度离心法[10]3种。

2.1 不连续性蔗糖密度梯度离心法 不连续性蔗糖密度梯度离心法，其基本原理是利用蔗糖或蔗聚糖等小分子溶液，根据所离心的组织匀浆液的不同分子量，预先配制好不连续性浓度梯度，根据不同分子量组织在离心力和重力作用下的通透性和沉降速率不同，将匀浆液等置于梯度液顶层离心，在离心力和重力作用下，不同分子量的组织会在梯度液中分层分离，根据已知所需组织的生物学特点，判断其分层位置后取出进行相关研究。该方法于上世纪60年代最先由Whittaker等人运用，被奉为突触体制备的经典方法，至今仍然在许多组织提取和纯化实验中运用，运用领域十分广泛。其大致操作流程如图1所示：

图1 经典方法制备突触体[2，8]

1996年中国台湾学者Tong等[7]为研究泌尿系统膀胱的神经生理学和神经药理学作用，运用该方法尝试从膀胱组织中提取突触体并获得成功，简要操作步骤如下：(1)3月龄大的Wistar 大鼠，断头处死，沿腹白线快速取出膀胱；(2)迅速称重，用剪刀将膀胱剪为长度为2～5 mm的碎片；(3)将碎片置于含有浓度3 mmol/L，pH值为7.2的钠磷酸盐的0.32 mol/L的蔗糖液中匀浆；实验所有操作均在4 ℃条件下进行；(4)匀浆液1000 r/min离心10min；(5)将所得颗粒物质按上一步骤再次离心；(6)将离心后漂浮物收集17000 r/min离心20 min；(7)将颗粒物放入1.5 ml的0.32 mol/L的蔗糖液再悬浮并低速短暂离心；(8)按照Gray and Whittaker[8]的蔗糖梯度离心法将颗粒物置于梯度液；(9)梯度液超高速离心机100000 r/min离心60 min；(10)取位于0.8～1.2 M梯度带上的微粒物质，用标准液5倍稀释并低温离心机5000 r/min离心30 min，将微粒物置于1 ml的标准液中再悬浮，配方如下：NaCI 132 mmol/L，KCI 5 mmol/L，CaCl21.2 mmol/L，MgCI21.3 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，glucose 10 mmol/L，Tris-base 20 mmol/L；调pH至7.4，置于室温环境。该方法作为经典的提取方法，应用范围广泛，可以对中枢神经系统和外周神经系统的神经末梢进行提取和纯化，在被报道后的几十年间受到国内外学者的广泛重视和应用。

2.2 改进型方法 经典的蔗糖梯度离心法应用广泛，为突触体制备和研究做出了巨大贡献。但同时也存在制备时间长，高速离心次数过多和时间过长，无法保证突触体结构完整性等不足。最初阶段，为了提高效率，对于需要突触体进行递质分析的工作，多数学者直接运用P2部分(P2部分相当于离心后粗制线粒体部分，包含突触体、线粒体和细胞膜等)进行。但P2部分含有线粒体和溶酶体等相关的酶类，不同程度地干扰了递质分泌和代谢进程[1]。为了纠正这些缺点，学者在运用过程中不断进行改进以缩短制备时间，提高突触体纯度。1978年，有学者运用Ficoll/sucrose[9]方法制备突触体。作为一种制备方法，该方法和经典方法在原理和操作上有诸多相同，在此不做赘述。在突触体中，突触前神经末梢在结构上是比较牢固的，在匀浆时，神经元破碎而突触区仍可保留完整性。将组织放入等渗介质中匀浆，再用差速离心法分离匀浆液中各亚细胞结构组分。纹状体在调控大脑对行为能力和其他重要的认知能力方面具有重要作用，它主要接收来自大脑黑质区、丘脑区和大脑皮质的信息并加以处理，丘脑区和脑皮质主要传输兴奋性的信息，这一作用可能与谷氨酸受体有关，为了研究证实突触前膜促代谢性谷氨酸受体(mGlu receptor)激活调控谷氨酸的释放，1995年，国外学者East等[11]在前人方法基础上运用了如下方法制备突触体，具体步骤如下图2：

图2 突触体提取步骤[11]

East等人的方法是在密度梯度离心法的基础上根据自身实验室的条件和经验总结而来，采用差速离心法，部分改进了经典方法，降低了实验难度，提高了制备效率。1997年，日本学者[12]在NO抑制脑内突触体对5-HT的吸收作用的研究中，研究人员运用差异离心法制备突触体观察突触体与5-HT在不同剂量NO作用下的关系变化，他们所用的突触体的制备方法和该方法大致相同，也是根据自身经验在此基础上进行简单修改，可供参考。

2.3 不连续性Percoll 密度梯度离心法 Percoll 是一种含有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20 mosm/kg H2O)，粘度也很小，可形成高达1.3 g/ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000 r/min)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于 Percoll 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。经典的蔗糖密度梯度离心法和在运用过程中的相关改进方法，均可以制备出突触体，但有诸多的不足。近年来，随着Percoll试剂的广泛运用和推广，不连续性Percoll 密度梯度离心法制备突触体技术日趋成熟，其制备的突触体以其诸多优势被国外学者所采用。2008年，Nature Protocols杂志对该方法进行详细报道[13]，并对该方法的优势及详细步骤进行介绍。这更使得该方法在国外突触体制备技术上逐渐占据主导和领先地位。该方法自80年代被Nagy等人[10]报道以来，运用范围不断扩大，并不断改进而趋于成熟。如Bai and Witzmann[14]；Whittaker[15]，Hajos[16]等都运用Percoll密度梯度离心法成功制得符合研究要求的突触体。根据2008年Nature Protocols杂志对该方法的详细报道，具体实验步骤如图3：

图3 不连续性Percoll密度梯度离心法[13]

除此之外，近几年不断有人在此方法的基础上进行改进和完善，使得该方法更加高效便捷。2011年，Westmark等人[17]根据自己的制备经验，对该方法进行改进优化，使得突触体的制备更加简便。为节约实验时间和人力，制备出更高质量的突触体，2014年Murphy等人[18]发明了高通量、半自动化的制备仪器(eg. FastPrep Tissue and Cell Homogenizer，MP Biomedical，Santa Ana，CA，USA，#116004500，et al. )来提高突触体制备的效率。根据他们的报道，运用这一设备，他们的制备时间降至约35 min，这和传统方法的4～5 h相比，大大节省了研究人员的实验时间和劳动量，为突触体的制备提供了崭新的途径，这一技术可能使突触体的制备和神经生物学研究迈入快车道。

3 讨 论

突触体作为一个可被看作是具有完整结构和功能的活细胞的脱落神经末梢，它的成功制备是能够进行体外神经生理、神经病理和神经递质分泌等相关研究的前提。制备结构完整、具有活性的突触体，既是完成实验研究的必然要求，也应该是从事神经生物学和神经系统疾病实验研究人员的必备技能。在国内，目前这一工作的开展还不普及，制约了相关学科实验研究的发展。虽然不连续性蔗糖密度梯度离心法在国内有部分实验室应用比较成熟[19，20]，但该技术相对比较落后，存在制备时间较长、突触体完整性较差、梯度液易混淆等不足。随着实验研究的不断进步，经典方法得到不断改进以弥补该方法的不足。East等人在经典方法基础上的改进方法操作流程简单，不需要配制密度梯度液，部分纠正了经典方法的不足。但该法制备的突触体纯度和产出率较低，其活性有待检测，对于一般的突触体分析比较适宜，而对要求较高的神经分子生物学研究则需进一步纯化。不连续性Percoll密度梯度离心法作为一种新方法，2008年，Nature Protocols[13]完整介绍了Percoll密度梯度离心法并总结了该方法的优缺点。Percoll梯度液的优点：(1)目前最快速的制备有活性的突触体的方法。(2)全程是在等渗条件下进行，对突触体有很好保护性。(3)不需超高速离心，最大限度保证突触体结构完整性。(4)制备的突触体具有较高活性。(5)花费时间较少，所制得突触体运用范围广泛。存在的不足：(1)高纯度的突触体产出率相对较低，主要集中在第4梯度带，但对于大多数实验可以将3～4梯度带一同收集。(2)Percoll梯度液配制较费时，但该梯度液可以在实验前不超过24 h内提前配制备用。(3)该方法对离心机有特殊要求等。该方法作为目前较先进的制备方法在国外应用越发广泛，其诸多优势可填补经典方法的不足，但国内对关于这一技术制备突触体的有关文献仅有两篇[21，22]，且实验路线介绍比较简略。此外，国内实验室对突触体制备技术的报道文献很少且大都限于经典技术路线，这大大制约了国内相关方面的研究进程。显而易见，突触体的制备是一项十分有意义且要求相对较高的技术，它能将神经生物学的研究带入离体实验阶段，从微观上进行深入分析。同时，在此离体研究的基础上，若能和整体研究相结合，必然能促进神经生理、神经病理、神经生物学的研究。相信随着国内研究工作的深入发展，突触体的制备技术必然会被众多学科重视运用，为国内神经生物学的研究做出贡献。

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1003-2754(2016)03-0280-03

Q421；R338.1+3

2015-01-30；

2016-02-28

国家自然科学基金资助项目(No. 81273801)

(南京中医药大学中医儿科学研究所，江苏 南京 210023)

韩新民，E-mail：hxm1nj@163.com

综 述