神经生长因子与软骨缺损修复及结构重建的关系*

王玉林， 刘有才， 杜天文， 施万义， 赵继军， 赵尚军， 尹飞翔， 贺 敏

(包头医学院第一附属医院骨科四病区，内蒙古包头 014010)



神经生长因子与软骨缺损修复及结构重建的关系*

王玉林， 刘有才， 杜天文， 施万义， 赵继军， 赵尚军， 尹飞翔， 贺 敏

(包头医学院第一附属医院骨科四病区，内蒙古包头 014010)

目的：探讨神经生长因子(nerve growth factor，NGF)与软骨缺损修复及结构重建的关系。方法：取健康新西兰大白兔16只，手术制备膝关节软骨缺损模型，在股骨髁间关节面制造直径4 mm、深3 mm的骨软骨缺损，将骨缺损家兔模型随机分为实验组和对照组，每组8只。实验组在关节腔内注入NGF，1次/周，共注射4次；对照组不注入NGF，缺损空置。分别于术后第4周、第8周和第12周分别处死一批实验动物，取材，进行大体结构观察和组织学观察。结果：实验组术后4周软骨缺损处呈纤维连接修复，8周软骨缺损处部分软骨修复，12周软骨缺损处软骨呈结节状修复。结论：在家兔软骨缺损的膝关节腔内注射NGF，修复软骨缺损，具有一定的治疗效果。

神经生长因子；软骨缺损；透明软骨

修复缺损的关节软骨在骨科是一个比较难处理的问题，预后效果差，也成了近几年来基础和临床研究关注的焦点。关节软骨损伤大多伴有软骨下骨损伤，目前通过关节镜下单纯采用磨削、马赛克技术、软骨细胞治疗等手段都未达到理想的效果。以往人们的修复重点研究都在软骨上，没有考虑到软骨下骨，如果损伤较深，软骨的修复主要以纤维软骨修复为主，修复后的关节软骨退变比较严重，关节软骨本身比较薄，修复能力差，运用支架结构固定比较困难，且缺乏材料。本研究于2015年12月至2016年5月采用家兔关节制造关节软骨缺损模型，进行神经生长因子(nerve growth factor，NGF)关节腔内注射，观察该方法能否有效促进缺损软骨的修复，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选择16只健康成年家兔，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限，购自包头医学院动物实验室，标准饲料喂养，每笼1只，自由饮水和活动。动物房室温19～24 ℃，湿度(50.2±5.4)%。正常昼夜节律。

1.2 实验模型制备 家兔分笼饲养适应1周后，腹部注射10 %水合氯醛(1.25 mL/kg)麻醉，仰卧位固定于自制木板上，头偏向对侧，用约束带固定四肢，显露出手术部位，手术区域剪毛，用酒精消毒。取家兔后肢双侧膝关节外侧入路，切开关节周围组织进入关节腔，取膝关节伸直位将髌骨推向内侧，然后屈曲膝关节，显露股骨髁，在左右两侧用直径4.0 mm骨科环钻头按照实验设计在股骨的关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约3 mm。用盐水冲洗后逐层关闭切口。待家兔完全苏醒后放入笼中，常规分笼饲养。术后3 d内，以青霉素80万U肌肉注射预防感染，同时用碘伏清洁创口，2次/d。将16只家兔随机分为实验组和对照组，每组8只，实验组(16膝)：用微量注射器将NGF(注射用鼠神经生长因子，武汉海特生物制药股份有限公司)注入关节腔，20μg/次，1次/周，共4次。对照组(16膝)为空白对照，对骨缺损区不做任何处理。

1.3 标本制作 分别于术后第4周、第8周、第12周采用空气栓塞(耳缘静脉注射5 mL空气)分批处死家兔。处死后立刻解剖膝关节，暴露软骨缺损修复区域，用生理盐水冲洗干净，切开关节囊，显露关节，先制作大体标本，观察并摄像。然后用刀片取股骨内髁软骨缺损修复区及其周围的组织块，4 ℃条件下固定24 h，脱钙，对标本进行修整后用石蜡包埋，用数码照像机对缺损区的修复状况拍摄记录，然后行HE染色和甲苯胺蓝染色。

2 结果

2.1 大体形态观察 (1)术后4周：大部分实验组和对照组标本缺损区内出现红色肉芽组织样物，缺损区凹陷，填充量<30 %，与周围软骨界限比较明显。(2)术后8周：实验组标本缺损区内充填物为白色，质地光滑、细腻，半透明状,填充修复约占缺损区的60 %～70 %，对照组标本缺损区内充填物为白色，半透明状,中间凹陷，填充修复约占50 % 。(3)术后12周：实验组标本缺损区充填物质地更趋均匀一致，平坦，与周围连接较好，填充修复>80 %。对照组缺损区内大部分标本充填物为白色、半透明状，少部分标本填充修复占70 %～80 %。

2.2 组织学检查

2.2.1 HE染色观察损伤部位(洞)软骨的再生情况 (1)术后4周：对照组标本均表现缺损区未完全充填，优势再生组织为少量纤维组织，与周围软骨无相连；实验组标本均表现缺损区未完全充填，优势再生组织为纤维组织，与周围软骨无相连。(2)术后8周：对照组标本缺损区修复组织仍为纤维组织，凹陷，结构不完整，一部分标本基底有新骨形成。实验组标本可见修复组织为少量透明软骨样组织，部分标本稍凹陷。(3)术后12周：对照组标本的缺损修复组织为纤维组织，有较好的修复，其优势组织多为透明样软骨，表面光滑、完整，大部分标本与周围软骨连接较好，部分标本仍有部分连接不良，基底部新骨形成良好。实验组标本多为透明样软骨，表面光滑、完整，大部分标本与周围软骨有较好连接，基底部新骨形成良好。

2.2.2 甲苯胺蓝染色 (1)术后4周：实验组和对照组可见基质异染不明显。(2)术后8周：实验组可见基质异染明显，可见新生软骨与周围结合；对照组缺损底部有少量纤维组织，缺损周围软骨有退化。(3)术后12周：实验组标本可见新生软骨组织蓝染，与正常软骨相平行，软骨表型明显；对照组可见软骨组织蓝染，软骨表型较差。

3 讨论

关节软骨损伤后，自身修复能力比较差。关于软骨缺损修复，国内外进行了多方面多角度研究[1,2]，发现组织工程在软骨缺损及损伤修复中效果明显。有学者通过实验证实软骨缺损如果损伤到软骨下，早期靠肉芽组织充填，7～10 d后纤维母细胞分化为成软骨细胞，新的修复性软骨形成大约在损伤后的4～6周。目前临床上治疗软骨损伤时，主要采用关节镜下行软骨下骨钻孔和微骨折技术来形成新软骨组织[3]，软骨组织修复不是靠周围软骨组织爬行修复，而是新生血管形成和生长因子的共同作用。NGF促进骨折愈合的作用是在研究修复神经损伤的过程中偶然被发现的，NGF是一种多功能生长因子，在全身广泛分布。路晓淼等[4]在大鼠骨髄基质细胞分化过程中加入NGF，促进骨修复过程，是成骨诱导的向成骨细胞分化过程。此外，关于NGF对山羊骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的调节作用研究，证实了NGF能提高细胞骨形成的功能[5]。目前，在骨与软骨损伤修复的各个环节上，NGF与其它生长因子之间的相互关系还不甚明了，而明确NGF在软骨修复中的作用，将为治疗关节软骨缺损提供指导。本实验中应用NGF修复软骨缺损，具有一定的治疗效果，提示关节软骨缺损后通过关节腔内注射NGF可促进软骨缺损的修复。

目前仅观察到12周样本，而软骨损伤及缺损到什么时间能达到理想的修复效果，仍需要长时间、多样本的实验研究。随着人们对NGF生物学作用机制研究的不断深入，必将有助于指导临床上对软骨损伤的治疗，最大限度地缓解患者的痛苦。

[1] Montgomery SR,Foster BD,Ngo SS,et al.Trends in the surgicaltreatment of articular cartilage defects of the knee in the United States[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc,2014,22(9):2070-2075.

[2] Eldean Giebaly D,Twaij H,Ibrahim M,et al.Treatment of articularcartilage defects of the knee[J].Br J Hosp Med,2013,74(3):132-137.

[3] Gelse K,Klinger P,Koch M,et al.Thrombospondin-1 prevents excessive ossii cation in cartilage repair tissue induced by osteogenic protein-1[J].Tissue Eng Part A,2011,17(15):2101-2112.

[4] 路晓淼,张凯,高廷益,等.神经生长因子对大鼠骨髄基质细胞增殖和向成骨分化的影响[J].蚌埠医学院学报,2012,37(12):1412-1414.

[5] 路晓淼,王恩群,孙大永,等.神经生长因了对山羊骨髄间充质干细胞向成骨分化的调节作用[J].实用口腔医学杂志,2010,26(1):29-32.

包头市社会发展科技支撑项目(2015S2004-5-22)

2016-06-15)