肝癌诊断技术方法应用进展

黄述婧，娄金丽

（首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心，北京　10009）

·综 述·

肝癌诊断技术方法应用进展

黄述婧，娄金丽

（首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心，北京10009）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种严重威胁着人们健康的肝脏肿瘤，死亡率高居世界前五位，预后较差，而且有很高的复发风险。肝癌的早期诊断有助于病人得到及时有效的治疗，利于后期康复，所以发现有效的诊断方法对于提高病人的生存率十分必要。本文旨在探讨目前主要运用的肝癌诊断方法，分析各种诊断方法的优势与劣势，为诊断方法的改进提供一定的理论基础，同时为临床检验工作人员提供方法学参考，对于提高肝癌的检出率有一定的临床意义。

肝细胞癌； 诊断； 方法

肝癌作为威胁人们健康的恶性肿瘤，近几年一直呈高发趋势，国际癌症研究中心（IARC）报道每年全球肝癌死亡人数男性约50万、女性约20万［1］，我国是肝癌的高发国家，肝癌病死率高居我国恶性肿瘤病死率第二位［2］。早期肝癌不易诊断，导致很多患者错过最佳的治疗时期，故很多患者预后较差，且伴随着较高的复发率，5年复发率高达61.5%［3］，提高早期肝癌检出率能够争取更多的临床治疗时间，增加病人的治愈率，提高生存率。目前关于肝癌诊断的方法有很多，除了熟悉的病理学、影像学和临床检验诊断学（如甲胎蛋白AFP检测）等方法外，近几年研发了很多新的技术方法，比如基因芯片［4］、蛋白质芯片［5］、CD133肿瘤标志物检测［6］、微小RNA［7］等技术手段。本文将对传统的和新发现的肝癌诊断方法做一系统的介绍。

1 病理学方法

肝组织穿刺活检肝组织穿刺活检（肝穿），是目前诊断肝癌的金标准。肝穿一般需要在影像学方法的辅助下进行，先确定最佳穿刺位置，再通过穿刺针快速吸取非常少量的肝脏组织进行病理学检查，从而确定肝癌细胞的存在及其分化程度。肝穿病理诊断有较高的准确率，能够鉴别肝脏细胞是否癌变、肝癌的活动性、是原发性的还是继发性的，肝穿结果是肝癌病变分期的重要依据，同时肝穿还可以用于肝癌手术恢复期效果的评价［8］。但肝穿的缺点也十分明显，是一种有创性的检查手段，病人不容易接受，同时凝血紊乱和高血压的病人不适用。对于早期肝癌的诊断灵敏度不够高，如果肝癌范围较小，可能穿刺不到，导致漏诊，但与影像学结合检测会大大提高诊断率［9］。

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.032

收稿日期：2015-11-16；修回日期：2016-03-03

基金项目：中美英联合乙肝相关肝癌早期诊断分子标志物筛查及免疫机制研究（国家国际科技合作专项项目）2012DFA30850

作者简介：黄述婧，女，在读硕士研究生

通讯作者：娄金丽

2 细胞学方法

2.1腹水肝癌细胞检测 肝腹水中存在一定数量的脱落肝癌细胞，抽取肝癌患者腹水进行Giemsa、HE等细胞化学染色，可以有效地鉴别肝癌细胞，从而诊断肝癌。在早期肿瘤阶段，影像学检查发现不了典型的临床病变，但是肿瘤细胞由于其细胞间粘附力低，容易脱落，所以细胞学检查可以做到早发现、早诊断，由于方法简便、价格经济，可以作为肿瘤筛查的手段。但某些良性细胞发生异型性改变时使用此方法易误诊为癌细胞，另外还有取样不当、检查费时、容易漏诊、难以对肿瘤进行定位、抽腹水过程痛苦等缺点，所以此方法较少使用［10］。

2.2循环肝癌细胞检测 循环肝癌细胞指从原发性肝癌病灶脱落，进入外周血循环系统，定植到新的组织器官形成转移灶。用于循环肝癌细胞检测的系统目前只有Veridex公司推出的Cell Search系统，这是唯一一家被FDA批准上市的可做该系统的公司。其原理为使用一个锚定单抗的磁珠来吸附循环肝癌细胞，然后对其进行后续的细胞化学染色分析并进行诊断［11］。Cell Search系统有较好的特异性，能够从上亿的细胞中吸附单一的循环肿瘤细胞，精准度很高，每个标本约耗时10min，适用于检验科快速诊断。有文献报道一些循环肿瘤细胞不表达相应的配体（EpCAM），所以吸附率较低，易出现漏诊［12］。这个系统在2009年发明，目前其实际效果还有待于临床检验，但值得我们期待。

3 血清生化检测方法

3.1甲胎蛋白法 甲胎蛋白（AFP）是目前临床应用最广的肝癌血清学标志物。AFP在正常肝脏中的表达量极低，小于20ng/mL，肝细胞癌变之后AFP表达量会显著增加。由于AFP的表达也会受到肝炎、腹膜炎等疾病的影响，而且有10%肝癌患者AFP表达量也不升高，所以单独的AFP检测确诊肝癌的特异度都不高，约70%，AFP一般联合其他的方法检测早期肝癌［13］。目前对于AFP检测常用的方法为放射性免疫法（RIA）、酶联免疫法（ELISA）、胶体金免疫层析法（CIA）。RIA具有放射性，但是精确度高；ELISA耗时长，精确度不高；CIA试剂盒拥有快速、简便和较高的特异性，可以用于人群筛查。岩藻糖基化甲胎蛋白（AFP-L3）在2005年成为了FDA批准的唯一肝癌诊断标志物［14］，更适合肝癌的诊断，但是检测方法还需改进与发展。

3.2高尔基体蛋白73 高尔基体蛋白73 （GP73）是高尔基体膜上的整合蛋白，在病理状况下其脱落进入血清，Marrero［15］研究发现在肝癌患者血清中，GP73表达量明显高于肝硬化患者和正常人群，其检测肝癌的特异度为69%，灵敏度为75%，这已经和AFP相当，是一个非常重要而且敏感的肝癌血清学标志物。目前已经研发出用于GP73快速诊断的酶联免疫试剂盒，具有经济、方便、利于大规模筛查的优点，使得GP73的实验室快速诊断成为现实［16］。但是GP73属于新发现的血清标志物，其临床诊断价值的评价还有待于后续的研究来验证。

3.3α-L-岩藻糖苷酶 α-L-岩藻糖苷酶（AFU）自上世纪80年代就被发现并广泛的运用于临床检验中，是诊断肝癌的敏感血清学指标之一，其常与AFP联合诊断［17］。AFU的活性容易受到标本存放时间的影响，非肝癌的肝损伤也会造成血清中AFU的升高，所以特异性会降低。但是其可以作为早期筛查的一个指标，作为其他标志物的一个有效补充。

3.4γ-谷氨酰转移酶 γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）是肝损伤较为灵敏的指标，γ-GT主要分布在肝细胞和胆管上皮细胞内，正常人体内水平很低。肝细胞癌变时，癌细胞会逆向分化，具有胚胎期的特征，所以导致γ-GT合成增加，分泌到血清中，故血清γ-GT也明显升高，临床上常把γ-GT作为慢性肝炎伴肝硬化转为肝癌和肝癌复发的参考指标［18］。γ-GT在检测肝损伤方面灵敏度不及ALT，但是可以鉴别胆管是否癌变。γ-GT检测容易受到酒精、慢性肝炎的影响，所以其特异性有待于提高，目前作为肝癌诊断的主要辅助指标。

3.5血清异常凝血酶原 血清异常凝血酶原又称维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白质（protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ），也被称为脱-γ-羧基凝血酶原（Desγ-carboxy-prothrombin，DCP）PIVKA-II在肝细胞癌患者中可出现特异性上升，且血清中PIVKA-II水平与AFP水平无相关性，对AFP假阴性肝癌的诊断有一定的价值，可与AFP进行互补，联合使用PIVKA-Ⅱ和AFP检测可增加肝癌诊断的灵敏度［19］。同时，PIVKA-II还可作为监测肝癌预后的标记物［20］，帮助辨别具有高危复发风险或生存期短的肝癌患者，以便及时采取积极的治疗手段达到延长患者生存期的目的。但值得注意的是PIVKA-II有假阳性反应，患者维生素K缺乏或者应用维生素K抑制剂，由抗生素引起的肠道正常菌群的抑制，均可导致PIVKA-II值升高，此外也有HCC以外的肿瘤（如胃癌等消化系统肿瘤）引起PIVKA-II值增高的报道［21］。

4 新技术与新指标

4.1基因芯片 基因芯片是人类基因组计划的产物，是先进技术的代表。将大量的基因探针固定在硅片等支持物上，然后与样品中待检基因进行杂交，从而检测样品中是否含有待检目的基因。作为基因分析工具，具有高通量、低样本、高效率等特点［22］，适用于早期肝癌相关基因的大范围筛查，突破了单个基因不敏感的局限，具有广阔的应用前景。但是目前发现的肝癌相关基因还太少，随着更多肝癌相关基因的发现，基因芯片对于肝癌的早期诊断率会有所提高。

4.2蛋白质芯片 目前最主要的蛋白质芯片为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS），此技术在2002获得了诺贝尔化学奖。SELDI-TOF-MS能够发现与肝癌细胞相关的重要蛋白，可以用于肝癌的诊断和疗效监测。该方法具有样本需求量低、检测速度快、检测蛋白分子量广、高通量等优点，目前有条件的医院已经把此方法应用于乳腺癌、前列腺癌的检测，并且拥有80%～90%的检出率［23］。Petricoin［24］使用SELDI技术在血清中筛选出了卵巢癌特异性指标，已经获FDA批准用于临床，这一技术在肝癌相关蛋白的筛查中也已经有所运用［25］。但是这一技术目前价格昂贵，临床检查效果也有待于验证，尚不适用于临床推广。

4.3肝癌相关基因检测 目前发现的肝癌相关基因有米托蒽醌抗性基因（MXR7）、人类印迹基因（DLKl）、高尔基体蛋白73基因（GP73）、肝癌相关基因（HTA）等，这些基因都能够在一定程度上提示肝癌的发生，GP73研究较多，已经有了一定的应用。基因检测方法有RT-PCR、二代测序、基因芯片、基因表达分析、比较基因组杂交等，随着这些高新技术的发展，不久的将来就会推向临床应用，同时随着更多的与肝癌相关基因被深入研究、分析鉴定，肝癌的早期诊断就会变得更加容易。

4.4分子标志物检测 CD133是新发现的一种肝癌干细胞表面标志物，在肝癌干细胞表面高表达，可以对肝癌进行检测，肝癌细胞主要是从CD133+的肝癌干细胞分化而来，所以CD133对于早期肝癌的诊断具有很大的优势，但是肝癌干细胞数量较少，不易检测，所以提高CD133最低检测限是此指标推广使用的关键［26］，其他的相关标志物还有CD90、CD44等。同时microRNA在肝癌细胞中的表达谱具有一定的特征［27］，利用表达谱的不同对肝癌进行早期诊断也有了一定进展，主要方法为qRTPCR，由于microRNA在肝癌表面标志物和血清标志物出现之前就发生了变化，所以能够对早期肝癌诊断提供帮助。

5 结语及展望

肝癌的诊断对于其治疗与预后都起着重要作用，目前对于肝癌的早期检测方法有很多，但是都存在着不足，多种方法的联合诊断有利于提高早期肝癌的检出率。本文对肝癌诊断传统方法（病理学、细胞学、影像学、血清学）和新技术（基因芯片、蛋白质芯片、新标志物检测）的应用进行了分析，以期能够对临床医生选择检测方法提供一定的帮助。

［1］Su C H，Lin Y，Cai L.Genetic factors，viral infection，other factors and liver cancer：an update on current progress.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（9）：4953-4960.

［2］龚新雷，秦叔逵.系统化疗治疗晚期肝细胞癌的现状和研究进展.中国新药杂志，2014，23（17）：2008-2017.

［3］Xu Y，Sun H C，Tian B，et al.Establishment of green fluorescent protein-expressing hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potential：relevant models for in vivo monitoring of metastasis and angiogenesis.J Cancer Res Clin Oncol，2004，130 （7）：375-382.

［4］Liu J，Zhang Q，Li Z，et al.［Predication analysis of microarray data to determine altered gene profiles in liver carcinoma related to HBV-related cirrhosis］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2014，22（8）：625-630.

［5］Paradis V，Degos F，Dargere D，et al.Identification of a new marker of hepatocellular carcinoma by serum protein profiling of patients with chronic liver diseases.Hepatology，2005，41（1）：40-47.

［6］Chan A W，Tong J H，Chan S L，et al.Expression of stemness markers（CD133 and EpCAM）in prognostication of hepatocellular carcinoma.Histopathology，2014，64（7）：935-950.

［7］Wang D，Tan J，Xu Y，et al.Identification of MicroRNAs and target genes involvement in hepatocellular carcinoma with microarray data. Hepatogastroenterology，2015，62（138）：378-382.

［8］Rochey D C，Caldwell S H，Goodman Z D，et al.Liver biopsy. Hepatology，2009，49（3）：1017-1044.

［9］丛文铭.肝脏穿刺活检诊断临床病理学要则.临床与实验病理学杂志，2012，28（4）：359-361.

［10］王桂荣.实验室诊断原发性肝癌几种方法的比较与评价.中国民康医学，2008，20（8）：724.

［11］Hu B，Yang X R，Xu Y，et al.Systemic immune-inflammation index predictsprognosisofpatientsaftercurativeresectionfor hepatocellular carcinoma.ClinCancerRes，2014，20（23）：6212-6222.

［12］Kaifi J T，Kunkel M，Dicher D T，et al.Circulating tumor cell levels are elevated in colorectal cancer patients with high tumor burden in the liver.Cancer Biol Ther，2015，16（5）：690-698.

［13］徐海峰，杨华瑜，张宏冰，等.改变肝癌早期诊断和治疗现状的新肝癌血清标志物.基础医学与临床，2008，28（01）：104-108.

［14］Wong R J，Ahmed A，Gish R G.Elevated alpha-fetoprotein：differential diagnosis-hepatocellular carcinoma and other disorders. Clin Liver Dis，2015，19（2）：309-323.

［15］Marrero J A，Romano P R，Nikolaeva O，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma.J Hepatol，2005，43（6）：1007-1012.

［16］Li Q W，Chen H B，Li Z Y，et al.Preparation and characterization of anti-GP73 monoclonal antibodies anddevelopment of doubleantibody sandwich ELISA.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（5）：2043-2039.

［17］Bertino G，Ardiri A，Malaguarnera M，et al.Hepatocellualar carcinoma serum markers.Semin Oncol，2012，39（4）：410-433.

［18］Song P，Inagaki Y，Wang Z，et al.High Levels of Gamma-Glutamyl Transferase and Indocyanine Green Retention Rate at 15 min as Preoperative Predictors of Tumor Recurrence in Patients With HepatocellularCarcinoma.Medicine（Baltimore），2015，94 （21）：e810.

［19］Ertle J M，Heider D，Wichert M，et al.A combination of alphafetoprotein and des-gamma-carboxy prothrombin is superior in detection of hepatocellular carcinoma.Digestion，2013，87（2）：121-131.

［20］Wang B L，Tan Q W，Gao X H，et al.Elevated PIVKA-II is associated with early recurrence and poor prognosis in BCLC 0-A hepatocellular carcinomas.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（16）：6673-6678.

［21］Takano S，HondaI，WatanabeS，etal.PIVKA-II-producing advanced gastric cancer.Int J Clin Oncol，2004，9（4）：330-333.

［22］Miura N，Maeda Y，Kabe T，et al.Serum human telomerase reverse transcriptase messengerRNAasanoveltumormarkerfor hepatocellular carcinoma.ClinCancerRes，2005，11（9）：3205-3209.

［23］张辉，孔北华，曲迅.表面增强激光解吸电离飞行时间质谱在卵巢癌中的应用.国际肿瘤学杂志，2006，33（3）：225-228.

［24］Petricoin E F，Ardekani A M，Hitt B A，et al.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer.Lancet，2002，359 （9306）：572-577.

［25］Liu Y，Sogawa K，Sunaga M，et al.Increased concentrations of apo A-I and apo A-II fragments in the serum of patients with hepatocellular carcinoma by magnetic beads-assisted MALDI-TOF mass spectrometry.Am J Clin Pathol，2014，141（1）：52-61.

［26］Feng D，Wang N，Hu J，et al.Surface markers of hepatocellular cancer stem cells and their clinical potential.Neoplasma，2014，61 （5）：505-513.

［27］Boye A，Yang Y.Hepatic microRNA orchestra：a new diagnostic，prognostic and theranostic tool for hepatocarcinogenesis.Mini Rev Med Chem，2014，14（10）：837-852.

（檀叶青编辑）

Progress of the Diagnosis Methods for Hepatocellular Carcinoma

HUANG Shu-jing，LOU Jin-li
（Department of Clinical Laboratory，Beijing You’an Hospital of Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Hepatocellular carcinoma（HCC）is one type of liver tumor with mortality at top 5 in the world，poor prognosis and high risk of relapse，which threatens people’s health seriously.The early diagnosis of HCC contributes to effective treatment and recovery of patients.It is necessary to develop effective diagnosis methods to enhance the patient’s survival.Here we summarized the primary diagnosis methods of HCC at present and analyzed the advantages or disadvantages of these methods in order to provide theoretical basis for the improvement of diagnosis methods and methodology reference for clinical laboratories.We hope the study provides insightinto the better methods of increasing the detection rates of HCC.

Hepatocellular carcinoma； Diagnosis； Methods