参芎注射液对顺铂致小鼠耳毒性及耳蜗Caspase-3表达的影响

2016-12-17程胜男李海燕

实用临床医药杂志 2016年23期

张博, 陈颖, 黄喜, 程胜男, 李海燕, 王娜

(1. 湖北科技学院耳鼻咽喉教研室, 咸宁市中心医院耳鼻喉科, 湖北咸宁, 437100; 2. 湖北科技学院 10级耳鼻咽喉班, 湖北咸宁, 437100; 3. 湖北科技学院耳鼻咽喉教研室, 湖北咸宁, 437100)

张博1, 陈颖2, 黄喜2, 程胜男2, 李海燕2, 王娜3

目的探讨参芎注射液对顺铂致小鼠耳毒性及耳蜗半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响。方法将48只同月龄健康成熟小鼠随机分为对照组、参芎组、顺铂组、实验组。采用畸变产物耳声发射(DPOAE)和听性脑干反应(ABR)方法检测4组小鼠听力功能情况，并通过显微图像及光密度值对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)中的Caspase-3表达水平进行研究。结果在DPOAE检测中，顺铂组用药后在0.5 kHz频度时与对照组相比无显著差异，但在1、3、5、8 kHz频度的DPOAE幅值较对照组有显著下降(P<0.05); 实验组用药后在0.5、1 kHz频度时与顺铂组相比无显著差异，但在3、5、8 kHz频度的DPOAE幅值较顺铂组有显著增高(P<0.05)。在ABR检测中，顺铂组的ABR阈移较对照组有显著提高(P<0.05); 实验组的ABR阈移虽显著高于对照组(P<0.05), 但ABR阈移却显著低于顺铂组(P<0.05)。顺铂组小鼠的耳蜗SGC可见明显Caspase-3阳性染色，棕黄色颗粒弥散分布在其SGC的胞浆内；实验组小鼠耳蜗SGC 的Caspase-3阳性染色较顺铂组明显减弱，棕黄色颗粒显著减少(P<0.05); 实验组Caspase-3表达的光密度值显著低于顺铂组(P<0.05)。结论参芎注射液对顺铂致小鼠耳毒性具有一定的防护作用，可用于减轻顺铂耳毒性。

参芎注射液; 顺铂; 耳毒性; Caspase-3

顺铂是目前临床上应用较为广泛的抗肿瘤药物之一，常与其他化疗药物联合应用，目前较多用于治疗肺癌及食管鳞状细胞癌等[1-3]。但顺铂具有较为严重的肾毒性和耳毒性，从而限制其临床应用[4-6]。参芎葡萄糖注射液为复方制剂，盐酸川芎嗪和丹参素为其活性成分，具有抗血小板聚集、扩张冠状动脉、降低血液黏度、加速红细胞的流速、改善微循环和抗心肌缺血和心肌梗死的作用[7-8]。本研究建立顺铂致耳毒性小鼠模型，通过检测小鼠的畸变产物耳声发射(DPOAE)、听性脑干反应(ABR)及小鼠耳蜗SGC的Caspase-3表达水平，比较参芎葡萄糖注射液对顺铂致小鼠耳毒性的防护作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择同一实验室同一批次饲养的同月龄健康成熟小白鼠48只(校实验动物中心提供)，耳廓反射正常，体质量28～32 g, 雌雄不限。小鼠随机分成4组，即对照组、参芎组、顺铂组、实验组，每组12只。对照组小鼠平均体质量(29.15±0.35) g; 参芎组小鼠平均体质量(29.11±0.48) g; 顺铂组小鼠平均体质量(28.86±0.42) g; 实验组小鼠平均体质量(29.07±0.42) g。各组小鼠的年龄、体质量均无显著差异。将各组小鼠自由饮食，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 给药方式

对照组给予腹腔注射生理盐水, 0.25 mL/d, 连续5 d。参芎组给予腹腔注射参芎葡萄糖注射液4 mL/(kg·d)(贵州景峰注射剂有限公司，国药准字H52020703), 连续5 d。顺铂组给予腹腔注射顺铂4 mg/(kg·d)(齐鲁制药有限公司，国药准字H37021358), 连续5 d。实验组在每天注射顺铂前30 min腹腔注射参芎葡萄糖注射液4 mL/(kg·d), 连续给药5 d。

1.3 DPOAE检测

将4组小鼠均置于隔音室内，采用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，采用CAPELLA耳声发射分析测试系统进行麻醉后小鼠进行DPOAE检测。选择初始纯音f1和f2，f1/f2=1.22, 强度差L1-L2=10 dB SPL, 以超出本底噪音3 dB为DPOAE检出标准，测试频率(f02=f1×f2)作为0.5、1、3、5、8 kHz的幅值。

1.4 ABR阈移检测

在隔声室内，分别检测各组小鼠给药前和停药后24 h在8、16、24 kHz三个不同频度下的ABR阈值。操作方法为先将各组小鼠经1%戊巴比妥钠按90 mg/kg腹腔注射麻醉，正电极固定于小鼠正中头皮，负电极固定于小鼠耳廓下的皮下，用短声作刺激声，扫描频率≤3 000 Hz, 扫描叠加次数为500～512次。刺激强度从95 dB SPL开始，以5 dB SPL依次递减，ABR阈值判定以刚有Ⅰ波为准，由同频率下的给药前后的阈值差计算ABR阈移。

1.5 免疫组化标本制备[9]

将4组小鼠测试完DPOAE和ABR后，立即扭断脊椎致死，并立即摘取听泡，充分显露耳蜗，挑破卵圆窗、蜗窗。蜗顶钻孔，用细玻璃管将4%多聚甲醛从蜗尖至蜗底灌洗数次，并将标本置于该固定液中放入4℃冰箱过夜。依次冲洗，行脱水、透明化、石蜡包埋等处理，以蜗轴为长距，平行连续做3 μm切片样本。石蜡切片在58℃孵箱中化蜡2 h，常规脱蜡、水化。配置弱酸性(pH 6.0)枸橼酸盐缓冲液，然后用缓冲液行热修复处理，常H2O2孵育10 min, 滴入Caspase-3抗体(1∶100稀释)，冷藏24 h以上。次日取出切片后，先行PBS冲洗处理，持续清洗4 min, 然后按此方法再清洗2次，再滴入二抗，再次孵育20～30 min, 重复上一步PBS冲洗，再行显色、染色、脱水、封片等处理；采用生物显微镜观察切片标本。

1.6 Caspase-3表达图像分析

采用病理图像分析系统对免疫化切片图像进行分析，记录各组小鼠耳蜗SGC的Caspase-3表达阳性的光密度值，得平均光密度值。

2 结果

2.1 各组小鼠一般活动情况

对照组小鼠的活动无明显异常表现；参芎组小鼠的活动也无明显异常表现；顺铂组小鼠毛发脱落较为严重，饮食趋于减少，且反应不够灵敏；实验组小鼠较顺铂组小鼠的饮食有所增加，但不规律，时多时少，毛发也无明显脱落，但较对照组小鼠稀疏，反应能力较顺铂组灵敏。

2.2 各组小鼠的DPOAE检测

对照组和参芎组相比较, DPOAE幅值无显著差异(P>0.05); 顺铂组用药后在0.5 kHz频度时与对照组相比无显著差异(P>0.05), 但在1、3、5、8 kHz频度的DPOAE幅值较对照组显著下降(P<0.05); 实验组用药后在0.5、1 kHz频度时与顺铂组相比无显著差异(P>0.05), 但在3、5、8 kHz频度的DPOAE幅值较顺铂组有显著增高(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠各频率下DPOAE幅值 dB SPL

与对照组相比较, *P< 0.05; 与顺铂组相比较, #P< 0.05。

2.3 各组小鼠的ABR阈移检测

用药后对照组和参芎组的ABR阈移比较无显著差异(P>0.05); 顺铂组的ABR阈移较对照组有显著提高(P<0.05); 实验组的ABR阈移虽显著高于对照组(P<0.05), 但该组的ABR阈移却显著低于顺铂组(P<0.05), 表明参芎注射液对顺铂耳毒小鼠的听力明显改善。见表2。

表2 各组小鼠ABR阈移比较 dB SPL

与对照组相比较, *P<0.05; 与顺铂组相比较, #P<0.05。

2.4 各组小鼠耳蜗SGC的Caspase-3表达

对照组和参芎组的小鼠耳蜗SGC的Caspase-3阳性染色不明显(图1A、B); 顺铂组小鼠的耳蜗SGC可见明显Caspase-3阳性染色，其免疫反应产物呈棕黄色颗粒，弥散分布在其SGC的胞浆内(图1 C); 实验组小鼠耳蜗SGC的Caspase-3阳性染色较顺铂组明显减弱，棕黄色颗粒显著减少(图1D), 表明顺铂致耳蜗损伤与Caspase-3表达有关，参芎注射液对Caspase-3表达有明显的改善作用。

2.5 图像分析结果

对照组和参芎组小鼠用药后的耳蜗SGC的Caspase-3表达阳性平均光密度无显著差异(P>0.05); 顺铂组和实验组小鼠用药后的耳蜗SGC的Caspase-3表达阳性平均光密度较对照组有显著差异(P<0.05), 且实验组小鼠的耳蜗SGC的Caspase-3表达阳性平均光密度较顺铂组有显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠耳蜗SGC的Caspase-3表达量平均光密度比较

与对照组相比较, *P<0.05; 与顺铂组相比较, #P<0.05。

3 讨论

畸变产物耳声发射(DPOAE)和听性脑干反应(ABR)为听力功能检测的两个测试方法。DPOAE检测可以反映耳蜗外毛细胞在不同频率下的功能，但其也有局限性，不能检测神经听觉通路的相关状态，以致出现一些假阴性诊断；而ABR检测却能检测听觉神经的相关损伤，所以一般将两种检测相互结合使用[10]。本研究中采用DPOAE和ABR方法对各组小鼠的听力功能进行检测。在DPOAE检测中，顺铂组用药后在0.5 kHz频度时与对照组相比无显著差异，但在1、3、5、8 kHz频度的DPOAE幅值较对照组有显著下降(P<0.05); 实验组用药后在0.5、1 kHz频度时与顺铂组相比无显著差异，但在3、5、8 kHz频度的DPOAE幅值较顺铂组有显著增高(P<0.05), 提示顺铂致耳毒性可能为听力高频度损伤。在ABR检测中，顺铂组的ABR阈移较对照组有显著提高(P<0.05); 实验组的ABR阈移虽显著高于对照组(P<0.05), 但该组的ABR阈移却显著低于顺铂组(P<0.05)。两种方法检测结果均表明参芎葡萄糖注射液对顺铂致小鼠耳毒性的听力功能有明显改善作用。

A. 对照组; B. 参芎组; C. 顺铂组; D. 实验组

图1 各组小鼠耳蜗SGC的Caspase-3表达 400倍

近年来不少研究报道顺铂致耳毒性与细胞凋亡途径密切相关。一方面，由于Caspase的激活又与细胞凋亡途径有关，而Caspase-3为细胞凋亡中的一种关键蛋白酶。本研究中通过免疫化染色显微图像及光密度分析发现参芎葡萄糖注射液能够降低顺铂致小鼠耳蜗中Caspase-3表达，从而改善顺铂对小鼠的耳毒性损伤。另一方面，有研究[11]发现顺铂致耳蜗细胞凋亡与自由基有关，即耳蜗组织与顺铂结合会导致自由基的急剧增加。过多的活性氧自由基会增加脂质过氧化和Ca2+内流，从而导致耳蜗细胞凋亡。参芎葡萄糖注射液由盐酸川芎嗪和丹参素组成，研究[12-13]报道川芎嗪和丹参素均具有明显的抗氧化作用。可能正是由于盐酸川芎嗪和丹参素具有明显的抗氧化作用，使复方制剂参芎葡萄糖注射液能够清除自由基，从而降低耳蜗细胞的脂质过氧化、抑制Ca2+内流，起到保护耳蜗细胞的作用，以改善顺铂耳毒性。

综上所述，参芎葡萄糖注射液能有效降低顺铂致小鼠的耳毒性，减轻听功能的损伤，抑制耳蜗SGC的Caspase-3表达，因此其对顺铂致耳毒性能起到一定的防护作用。

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Effect of shenxiong injection on cisplatin-induced ototoxicity and Caspase-3 expression in mouse cochlea

ZHANG Bo1，CHEN Ying2，HUANG Xi2，CHENG Shengnan2，LI Haiyan2，WANG Na3

(1.TeachingandResearchSectionofOtolaryngologyofHubeiUniversityofScienceandTechnology,DepartmentofOtolaryngologyofXianningCentralHospital,Xianning,Hubei, 437100; 2.ClassofOtorhinolaryngology,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning,Hubei, 437100; 3.TeachingandResearchSectionofOtolaryngologyofHubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning,Hubei, 437100)

Objective To explore the effect of shenxiong injection on cisplatin-induced ototoxicity and Caspase-3 expression in mouse cochlea. Methods A total of 48 adult healthy mice were randomly divided into normal saline control group, shenxiong group, cisplatin group and experimental group. Distortion product otoacoustic emitter (DPOAE) and auditory brainstem response (ABR) method were used for the detection of hearing function in the four groups. Caspase-3 expression of mouse cochlear spiral ganglion cells (SGC) was evaluated by microscopic images and the optical density value. Results In the DPOAE test, there was no significant difference between the cisplatin group and the control group before and after treatment at 0.5 kHz frequency, but the cisplatin group significantly decreased compared with the control group at 1, 3, 5, 8 kHz frequency (P<0.05). There was no significant difference between the experimental group and the cisplatin group before and after treatment at 0.5, 1 kHz frequency, but the experimental group significantly decreased compared with the cisplatin group at 3, 5, 8 kHz frequency (P<0.05). In the ABR test, ABR threshold shift

shenxiong injection; cisplatin; ototoxicity; Caspase-3

2016-08-11

R 595

1672-2353(2016)23-001-04

10.7619/jcmp.201623001

of the cisplatin group significantly improved compared with the control group (P<0.05). ABR threshold shift of experimental group was significantly higher than the control group (P<0.05), but ABR threshold shift of experimental group was significantly lower than the cisplatin group (P<0.05). Caspase-3 positive staining was found in the cochlea of mice SGC in the cisplatin group, the brown particles were dispersed in the cytoplasm of SGC. Caspase-3 positive staining in mice cochlear SGC of experimental group was significantly weakened than cisplatin group, brown yellow granules decreased significantly (P<0.05). The optical density value of Caspase-3 expression in experimental group was significantly lower than the cisplatin group (P<0.05). Conclusion Shenxiong injection has a protective effect on ototoxicity induced by cisplatin, and it can reduce the ototoxicity of cisplatin.