川西北牧区7个披碱草属新品系遗传变异分析

陈仕勇，马 啸，张昌兵，陈智华，李世丹，郑经红

(1. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2. 四川农业大学草业科学系，四川 成都 611130；3. 四川省草原科学研究院，四川 成都 611731)



川西北牧区7个披碱草属新品系遗传变异分析

陈仕勇1，马 啸2*，张昌兵3，陈智华1，李世丹1，郑经红1

(1. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2. 四川农业大学草业科学系，四川 成都 611130；3. 四川省草原科学研究院，四川 成都 611731)

本研究采用RAPD标记对来自川西北高寒牧区7个披碱草属新品系共11份材料进行遗传多样性和种间关系分析。试验筛选出的14条引物对11份供试材料进行RAPD扩增，结果共扩增出255条带，其中多态性的条带数为201条，多态性条带比率为78.82 %。材料间的遗传相似系数变幅为0.497～0.962，平均值为0.714。聚类分析结果能够明显将老芒麦和垂穗披碱草材料分开，同时揭示了不同新品系之间的遗传亲缘关系。其中垂穗披碱草组中Z0056与其它垂穗披碱草材料间遗传关系较远；老芒麦组中的供试材料之间的遗传关系都较近，其遗传背景比较狭窄。本研究结果将为川西北优良老芒麦和垂穗披碱草种质的鉴定、新种质创制及育种工作提供理论依据。

川西北；老芒麦；垂穗披碱草；RAPD；遗传变异

川西北高原牧区位于青藏高原东缘，地处四川省的西北部，与甘肃、青海、西藏相邻。它不仅是我国五大牧区之一，而且还是我国藏族等少数民族的主要聚居地区。草地畜牧业是川西北高寒牧区重要的经济支柱，而牧草则是发展草地畜牧业的基础。但是目前川西北牧区当家的牧草如老芒麦、垂穗披碱草等品种相对较少，一些品种在推广应用中还出现了不同程度的退化，而新品种的育种进程较慢，远不能满足草地畜牧业发展与生态建设的需要，亟待加快老芒麦、垂穗披碱草等优质高产饲草品种的选育工作。

老芒麦(ElymussibiricusL.)别名西伯利亚披碱草，是禾本科披碱草属的模式种。同时它为多年生疏丛型的异源四倍体禾草，具有StStHH的染色体组构成[1-2]。老芒麦一般生长于湿润的草地、河滩、灌木丛中或森林边缘地带。在我国主要分布在青藏高原、内蒙古以及新疆等地区[1,3]。因其具有适应性强、抗寒、粗蛋白高、易栽培等优良特性，被用于建植人工草地，对退化草地改良和种草养畜具有重要意义[4]。垂穗披碱草(ElymusnutansGriseb.)又名钩头草、弯穗草也是禾本科披碱草属的植物。它是多年生疏丛型的异源六倍体禾草，其染色体组构成为StStYYHH，在我国主要分布于西北、西南、华北各省[1-2]。垂穗披碱草具有广泛的生长可塑性和极强的抗寒性和抗旱性，从滩地、沟谷、阴坡山麓地带到灌丛草甸和高山草甸均能生长[3,5-6]。它与老芒麦都是高寒牧区的重要的牧草，为生态恢复和草地畜牧业发展均有重要的意义。目前老芒麦和垂穗披碱草的育种工作落后，不能满足生态和生产需要。同时育种手段单一，尤其对材料的遗传背景和亲缘关系等的了解较少。

表1 供试材料

随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是利用人工合成的随机引物(一般为10 bp)对供试的模板基因组DNA进行PCR扩增，然后利用凝胶电泳分离扩增产物的多态性，以反映全基因组DNA的多态性，具有快速、简便、成本低的特点[7]。目前已广泛应用于品种鉴定、系统发育、遗传图谱构建等方面[8-10]。本研究采用RAPD技术对川西北高寒牧区7个品系的11份材料进行遗传多样性和种间关系研究，旨在为高寒牧区的优质老芒麦和垂穗披碱草的种质鉴定及新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为来自于川西北高寒牧区的7个披碱草属新品系，包括3份垂穗披碱草(Elymusnutans)新品系和4份老芒麦(E.sibiricus)新品系。另外包括国审品种甘南垂穗披碱草、川草2号老芒麦。供试材料由四川省草原科学研究院提供，供试材料的具体情况如表1所示。

1.2 RAPD分析

1.2.1 DNA提取及PCR扩增 在试验地小区随机采取10株植物的叶片混合在液氮中研磨成粉末，并采用改良的CTAB法[11]提取基因组DNA。对所提取的DNA样品采用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行纯度和浓度的检测。

扩增反应体系为20 μl：0.2 mM dNTPs, 0.75 μM引物，2.5 mM Mg2+，10 ×Taqbuffer，1 UTaqDNA 聚合酶，20 ng模板DNA。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共45个循环；最后72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物在1.5 %琼脂糖凝胶(含有0.1 mg/mL的溴化乙锭)上用0.5 × TBE 缓冲液进行电泳分离2.5 h，并用BIO-RAD自动凝胶成像系统照相保存。

1.2.2 数据分析 将RAPD实验扩增产物的每一个条带均视为一个位点，然后统计本研究中扩增的总位点数及多态性位点数。按照条带的有、无分别进行赋值，有带的记为1，无带的则记为0。本研究中供试材料间的遗传相似系数(Genetic similarities，GS)则按照Nei-Li的方法进行计算[12]。其相关的计算公式为：GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij为供试物种材料i和j中共有的扩增位点的数目，Ni表示材料i中出现的扩增位点的数目，Nj代表材料j中出现的扩增位点的数目。另外，在分析软件NTSYS 2.1中，根据不同材料间的遗传相似系数GS值采用不加权成对群算术平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)进行聚类分析和主成分分析[13]。

2 结果与分析

2.1 RAPD扩增结果及多态性

从供试的RAPD引物中共筛选选出了14条条带清晰且重复性好的的引物进行进一步地扩增，结果一共扩增得到255条带，其中多态性条带数为201条，多态性条带比率为78.82 %。本研究中所扩增的DNA片段大小均在2000～200 bp (图1)。其中平均每个引物所获得的条带数为18.21条，变幅为15～26条；平均多态性的条带数为14.35条，变幅为10～23条(表2)。这也表明在本研究中RAPD标记能够检测出较多的遗传位点。

表2 RAPD引物序列及扩增结果

图1 RAPD扩增结果电泳图Fig.1 PCR amplification patterns

图2 11份材料基于遗传相似系数GS的UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram of 11 materials based on genetic similarity coefficients

2.2 遗传相似系数

对RAPD分子标记的扩增结果采用Nei-Li遗传相似系数(GS值)分析材料间的遗传关系。供试的11份材料间的GS值在0.497～0.962，平均GS值为0.714。垂穗披碱草0056和老芒麦E03025之间的遗传相似系数最小为0.497，遗传距离最大。老芒麦E03044与E03025之间的遗传相似系数最大为0.962，遗传距离最小。从遗传相似系数比较可以看出老芒麦和垂穗披碱草种间的遗传相似系数差异较明显，遗传距离较大。在4份垂穗披碱草材料中，GS值在0.769～0.922，平均值为0.840。在7份老芒麦材料中，GS值在0.883～0.962，平均值为0.922。遗传相似系数的分析结果表明了老芒麦和垂穗披碱草的各品系之间具有较高的遗传相似系数，遗传距离较近，亲缘关系也较近。同时也可以看出不同物种的各个品系之间存在变异，但是变异程度较低，遗传多样性水平较低。

2.3 聚类分析和主成分分析

基于遗传相似系数GS值对11份材料进行UPGMA聚类分析。从聚类图(图2)上可以明显将11份材料分成老芒麦和垂穗披碱草组两类。垂穗披碱草组中Z0056与其它关系较远，其遗传背景与其他垂穗披碱草材料的差异较大，这可能与它来自生态地理位置相对较远的稻城有关。这也表明Z0056可以作为杂交育种的备选亲本材料。在老芒麦组中，各个材料都表现了很近的亲缘关系，这也反应了供试的老芒麦的遗传背景差异不大，相似程度较高。这可能因为它们同来自红原、若尔盖生态地理环境都非常的相似，甚至有些材料来自同一地点。对11份材料基于遗传相似系数数据进行主成分分析，主成分图(图3)更能直接表现各个材料的遗传关系。在图中位置较近的关系较密切，位置较远则关系较疏远。主成分分析结果与聚类分析结果一致。

3 讨 论

本研究采用14条引物共扩增出255条带，其中201条为多态性条带，对老芒麦和垂穗披碱草2个物种11份材料的255个位点进行了检测。这也体现出分子数据具有比形态学和细胞学标记更多的信息和更高的标记效率，是物种遗传多样性研究中最为有效的手段。本研究中RAPD揭示的多态性条带比率为78.82 %，高于李小雷等[14]研究加拿大披碱草和肥披碱草及杂种关系的72.1 %，以及王树彦等[15]研究加拿大披碱草和老芒麦及杂种关系的61.29 %，但低于周永红等[2]对10个披碱草属物种进行系统学分析的81.6 %，也低于杨瑞武等[16]对披碱草属、鹅观草属和猬草属模式种亲缘关系分析的88.62 %。这与本研究选用的物种和材料较少而且亲缘关系较近有关，同时也说明RAPD标记适合于披碱草属物种遗传多样性及系统学的研究。

图3 11份材料基于遗传相似系数GS的主成分分析图Fig.3 The principal coordinate analysis of 11 materials based on GS data

本研究中RAPD分析能明显将老芒麦和垂穗披碱草按照倍性进行区分。周永红等[2]等同样采用RAPD分析10个披碱草属物种，聚类结果将供试材料按照倍性进行了区分，与本研究得到了相似的结果。李永祥等[17]采用ISSR和SSR对披碱草属的12个物种进行分析，聚类分析结果将12份材料主要按照穗状花序形态进行了划分，并没有按照物种的倍性进行区分。这可能是因为不同的分子标记具有不同的特点，可以提供不同的材料间信息。这可能也说明RAPD标记在鉴定老芒麦和垂穗披碱草两个物种上更具优势。由于老芒麦和垂穗披碱草两物种的形态学特征非常相似很难区分，所以可以筛选出一些物种的特异分子标记(如图1箭头处)加以鉴定[18]。因此，在以后的研究中应该采用多种标记对材料进行分析，以求更全面、准确得到材料间的遗传信息，为材料间的杂交等育种工作提供有益的信息。

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(责任编辑 陈 虹)

Genetic Diversity of Seven New Cultivars ofElymusin Pasturing Area in Northwest Sichuan

CHEN Shi-yong1, MA Xiao2*, ZHANG Chang-bing3, CHEN Zhi-hua1, LI Shi-dan1, ZHENG Jing-hong1

(1.College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Sichuan Chengdu 610041，China; 2.Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Sichuan Chengdu 611130,China; 3.Sichuan Academy of Grassland Science, Sichuan Chengdu 611731，China)

The genetic diversity and interspecific relationships among 11Elymusspecies, collected from Northwest plateau Sichuan, were analyzed by RAPD markers. A total of 255 bands amplified by 14 primers were detected, of which a total of 201 bands were polymorphic. The genetic similarity (GS) values based RAPD data of 11 materials ranged from 00.497-0.962 with a mean of 0.714. The materials ofE.sibiricusandE.nutanscould be devided by cluster analysis based on RAPD data, which also revealed the phylogenetic relationships among the new lines ofElymus. TheE.nutansZ0056 showed a far genetic distance with otherE.nutans. However, the materials ofE.sibiricusshowed a narrow genetic background. The results of the study could supply the information for new materials innovation and new varieties breeding ofE.sibiricusandE.nutans.

Northwest Sichuan province;Elymussibiricus;Elymusnutans; RAPD; Genetic variation

1001-4829(2016)11-2549-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.007

2015-10-12

四川省教育厅重点项目(15ZA0388)

陈仕勇(1984-)，男，四川三台人，博士，主要从事牧草种质资源创新及育种研究，E-mail: chengshi8827@163.com，*为通讯作者，E-mail: maroar@126.com。

S543.9

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