鼻咽癌组织中己糖激酶2的表达及临床意义

刘 娜 翁闪凡 张晓林 陈 姝

(佛山科学技术学院，广东 佛山 528000)



鼻咽癌组织中己糖激酶2的表达及临床意义

刘 娜 翁闪凡 张晓林 陈 姝1

(佛山科学技术学院，广东 佛山 528000)

目的 探讨己糖激酶2(HK-Ⅱ)在鼻咽癌组织中的表达水平及其临床意义。方法 选择鼻咽癌患者活检组织25例作为观察组，另取同期慢性鼻咽部炎症患者活检组织为对照组，采用逆转录聚合酶链反应检测两组HK-Ⅱ mRNA的表达，采用免疫印迹法检测两组HK-Ⅱ蛋白表达。结果 观察组HK-Ⅱ mRNA和蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05)。鼻咽癌组织中HK-Ⅱ mRNA和蛋白的表达与淋巴结转移有关，且有淋巴结转移者表达高于无淋巴结转移者(P<0.05)；与年龄和性别无关(P>0.05)。结论 HK-Ⅱ的高度表达与鼻咽癌的发生、发展有关，可作为鼻咽癌靶向治疗的重要分子标志物。

鼻咽癌；己糖激酶2；靶向治疗

鼻咽癌是一种多基因遗传疾病，其发病与遗传易感性、环境因素、饮食习惯等多种因素有关〔1〕。目前，鼻咽癌发病机制尚不清楚，且其解剖位置隐蔽、早期症状不典型，容易造成漏诊、误诊，影响临床治疗。据报道〔2〕，鼻咽癌患者5年生存率仅为50%左右。不同病变程度的鼻咽癌患者放化疗敏感性等方面存在差异，因此，筛选鼻咽癌早期诊断以及预后相关的分子标志物对其治疗具有深远意义。己糖激酶2(HK-Ⅱ)在肿瘤组织异常糖酵解过程中发挥重要作用，是肿瘤细胞能量代谢的关键调节者〔3〕，与肿瘤细胞的增长、侵袭等密切相关。本研究探讨HK-Ⅱ在鼻咽癌组织中的表达水平及其表达的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年10月至2015年11月本院收治鼻咽癌患25例，分别经内镜取活检组织作为观察组；另选取同期我院20例慢性鼻咽部炎症患者，取黏膜活检组织为对照组。标本取出后即放入-75℃冰箱保存。观察组男17例，女8例；年龄24～77〔平均(45.82±12.07)〕岁；有淋巴结转移14例，无淋巴结转移11例。对照组男15例，女5例；年龄22～74〔平均(44.10±13.51)〕岁。观察组所有患者均未接受任何放化疗治疗，所有标本均经病理学诊断为低分化鳞状细胞癌。两组患者性别和年龄等基线资料无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 组织中HK-Ⅱ mRNA表达检测 采用逆转录聚合酶链反应检测两组HK-Ⅱ mRNA的表达。采用Trizol法提取组织中的总RNA。(1)取活检组织50 mg放入匀浆器，加入1 ml Trizol匀浆。(2)将匀浆液移入EP管，静置5 min。(3)加入0.2 ml氯仿，震摇15 s，静置2～3 min。(4)4℃、12 000 r/min离心15 min。(5)将最上层无色液体移至另一EP管。(6)加入异丙醇500 μl，上下颠倒EP管，混匀液体，静置10 min。(7)4℃、12 000 r/min离心15 min，去除上清液。(8)加75%乙醇1 ml洗涤沉淀，4℃、7 500 r/min离心5 min，去除上清液。(9)加无水乙醇1 ml洗涤沉淀，室温下干燥5～10 min。(10)加入无菌焦碳酸二乙酯(DEPC)水30 μl溶解沉淀。

1.2.2 组织中HK-Ⅱ蛋白表达检测 采用免疫印迹法：(1)蛋白提取：剪碎组织，加入裂解液，充分匀浆裂解，10 000 r/min离心5 min，取上清液备用。(2)蛋白变性：按照4∶1比例加入蛋白上样缓冲液，PCR仪99℃变性10 min，-75℃冰箱保存。(3)测定提取标本蛋白浓度：将试剂盒A液、B液混合成工作液配置蛋白标准品，加入96孔板，每孔2 μl，加PBS补足20 μl；所有孔均加入二喹啉甲醛(BCA)工作液200 μl，温箱孵育；测定浓度、绘制蛋白标准曲线，计算蛋白浓度。(4)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白电泳、转膜、免疫反应、化学发光、显影、定影，用Image-Pro软件扫描蛋白条带OD值，HK-Ⅱ条带/β-actin比值即为蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 两组HK-Ⅱ mRNAⅡ和蛋白表达对比 观察组HK-Ⅱ mRNA表达(0.61±0.04)和HK-Ⅱ蛋白表达(0.49±0.15)均显著高于对照组(0.06±0.03、0.11±0.05)(t=51.030、10.837，P<0.05)。

2.2 鼻咽癌组织HK-Ⅱ表达与临床因素的关系 鼻咽癌组织中HK-Ⅱ mRNA和蛋白的表达与淋巴结转移有关，有淋巴结转移者表达高于无淋巴结转移者(P<0.05)；与年龄和性别无关(P>0.05)。见表1。

表1 HK-Ⅱ表达与临床因素的关系

3 讨 论

鼻咽癌患者早期临床表现不典型，就诊时约60%的患者出现颈部淋巴结节转移，约20%出现脑神经受累，在积极治疗后，仍有20%～30%的患者病情得不到有效控制，发生远处转移等〔4，5〕。HK催化葡萄糖为6-磷酸葡萄糖，是催化糖酵解过程的第一步关键酶，在正常组织中含量很少，主要分布在肌肉、脂肪组织和肺组织中。HK有四种亚型：HK-Ⅰ、HK-Ⅱ、HK-Ⅲ、HK-Ⅳ，在肿瘤组织中HK-Ⅱ表达最为活跃〔6〕。HK-Ⅱ通过催化糖酵解过程中的产物被肿瘤细胞利用，促进肿瘤的生长和侵袭。在Warburg效应研究中〔7〕，发现HK-Ⅱ与肿瘤细胞糖酵解水平密切相关。HK-Ⅱ成为肿瘤生长代谢中的分子干预靶点，可用于癌症的分子靶向治疗。Kwee等〔8〕研究发现，46.54%的肝细胞癌标本检测到HK-Ⅱ阳性表达；彭国庆等〔9〕研究发现，HK-Ⅱ表达与宫颈癌病变程度正向相关；Sato-Tadano等〔10〕研究发现，乳腺癌转移时HK-Ⅱ的生物活性及表达量均显著增高。

HK-Ⅱ在肿瘤组织中的作用机制主要包括促进葡萄糖代谢和抑制肿瘤细胞凋亡两个过程，HK-Ⅱ与线粒体外膜蛋白(VDAC)结合，形成线粒体结合型HK-Ⅱ，能够选择性的利用线粒体产生的三磷酸腺苷(ATP)，促进肿瘤细胞的糖酵解过程。线粒体结合型HK-Ⅱ参与线粒体膜通透转换孔复合物(PTP)的构建，能够抑制促凋亡因子，阻止线粒体途径诱导的凋亡，进而抑制肿瘤细胞的凋亡，包括肿瘤细胞的生长和增殖〔11〕。

本研究结果发现，HK-Ⅱ的高度表达与鼻咽癌的发生、发展及肿瘤细胞的侵袭能力有关，即高度表达的HK-Ⅱ能够促进糖酵解，为肿瘤生长提供物质基础；与相关研究结果一致〔12〕。且糖酵解产生的酸性代谢物能够破坏正常细胞基质进一步为肿瘤的转移和侵袭提供有利环境。HK-Ⅱ的表达在不同年龄和性别鼻咽癌患者间尚未表现出显著性差异，有待进一步研究。

1 Xiao L,Hu ZY,Dong X,etal.Targeting epstein-barr virus oncoprotein LMP1-mediated glycolysis sensitizes nasopharyngeal carcinoma to radiation therapy〔J〕.Oncogene,2014;33(37):4568-78.

2 董 欣.鼻咽癌中糖酵解与脂肪酸β氧化异常活化的机制研究〔D〕.长沙：中南大学,2014.

3 陈丽霞.采用蛋白质组学技术筛选鼻咽癌转移相关蛋白〔D〕.桂林：广西医科大学,2009.

4 Deng Q,Yu X,Xiao L,etal.Neoalbaconol induces energy depletion and multiple cell death in cancer cells by targeting PDK1-PI3-K/Akt signaling pathway〔J〕.Cell Death Dis,2013;4:e804.

5 郝俊芳,杨新华,董 伟,等.鼻咽癌的个体化治疗〔Z〕.山东省医学科技三等奖,2012.

6 姜汉国.PI3K/AKT信号传导通路与鼻咽癌侵袭转移关系的研究〔D〕.济南：山东大学,2010.

7 魏 婷.下调N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V对鼻咽癌细胞CNB-2恶性生物学行为的影响〔D〕.广州：南方医科大学,2011.

8 Kwee SA,Hernandez B,Chan O,etal.Choline kinase alpha and hexokinase-2 protein expression in hepatocellular carcinoma:association with survival〔J〕.PLoS One,2012;7(10):e46591.

9 彭国庆,尹红玲,田 焱,等.糖酵解限速酶HK-2与宫颈组织癌变的关系〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2010;26(9):941-2.

10 Sato-Tadano A,Suzuki T,Amari M,etal.Hexokinase II in breast carcinoma:a potent prognostic factor associated with hypoxia-inducible factor-1α and Ki-67〔J〕.Cancer Sci,2013;104(10):1380-8.

11 Shen YA,Wang CY,Hsieh YT,etal.Metabolic reprogramming orchestrates cancer stem cell properties in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cell Cycle,2015;14(1):86-98.

12 梁莉丽,孙 迪,宋海涛,等.局部晚期鼻咽癌患者外周血VEGF检测及意义〔J〕.现代生物医学进展,2015;15(3):510-3.

〔2015-10-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

2012年佛山市医学类科技攻关项目(No.201208065)

张晓林(1960-)，男，硕士，副教授，主要从事重大疾病生化与分子机制方面的研究。

刘 娜(1978-)，女，硕士，讲师，主要从事肿瘤能量代谢方面的研究。

R76

A

1005-9202(2016)22-5616-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.055

1 佛山市第一人民医院临床研究所