丹参酮通过抑制miR-376b-5p逆转自发性高血压大鼠左室重构

陈 强 陈丽珠 郭晓华

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心内科，内蒙古 包头 014010)



丹参酮通过抑制miR-376b-5p逆转自发性高血压大鼠左室重构

陈 强 陈丽珠 郭晓华

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心内科，内蒙古 包头 014010)

目的 探讨miR-376b-5p在丹参酮逆转老年自发性高血压大鼠(SHR)左室重构中的作用。方法 将60只17月龄的SHR随机分为对照组、丹参酮组和丹参酮+miR-376b-5p组(n=20)，其中丹参酮组和丹参酮+miR-376b-5p组接受5 ml·kg-1·d-1的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液灌胃处理，连续12 w；此外，丹参酮+miR-376b-5p组尾静脉注射过表达miR-376b-5p的慢病毒载体，对照组接受5 ml·kg-1·d-1的生理盐水灌胃处理。12 w后分离右侧颈总动脉，采用PowerLab生物信号记录分析系统分析血压及血流动力学指标〔左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP) 和左心室压力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)〕，称量体质量及左心室质量并计算左心室质量指数。取左心室中部冠状切面石蜡切片行HE染色、Masson染色以评估左室重构情况(心肌细胞直径、心肌间质纤维化指数和心肌血管周围纤维化指数)。结果 与对照组相比，丹参酮组的收缩压、舒张压、平均动脉压及LVSP和LVEDP均降低，±dp/dt max均升高(P<0.05)；丹参酮组的左心室质量、左心室质量指数、心肌细胞直径、心肌间质纤维化指数及心肌血管周围纤维化指数均低于对照组。miR-376b-5p过表达后可消除丹参酮对SHR血压及左心室重构的保护效果，丹参酮+miR-376b-5p组的以上指标与对照组均无统计学差异(P>0.05)。结论 丹参酮对老年SHR左室重构有保护作用，而过表达miR-376b-5p可消除丹参酮对老年SHR左室重构的逆转作用，提示丹参酮可能通过降低miR-376b-5p水平发挥对老年SHR左室重构的保护作用。

miR-376b-5p；丹参酮；自发性高血压；左室重构

左室重构是高血压患者发生心血管事件的重要危险因素，主要包括心肌肥大及心肌纤维化，前者为心肌纤维对慢性压力或容量负荷的适应性反应，后者是心肌肥大过程中伴有胶原纤维过度沉积，最终导致心功能恶化〔1,2〕。目前在高血压治疗中，理想的治疗措施应在有效降压的同时对左室重构有改善效果。丹参酮具有较广泛的心血管保护作用，同时对心室重构有较好的保护作用〔3,4〕。MicroRNAs(miRNAs)可调控基因的表达，且在多种心血管病理过程中发挥作用，如心肌纤维化、心肌肥厚、心力衰竭与心律失常〔5～7〕。miR-376b-5p是一种具有多种生物活性的microRNA，可参与M3受体对心肌的保护作用〔8〕，同时可调控脑缺血后血管新生〔9〕。本研究在老年自发性高血压大鼠(SHR)中发现，miR-376b-5p参与了丹参酮对老年SHR左室重构的逆转过程。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液购自上海第一生化有限公司，高表达miR-376b-5p的慢病毒载体购自上海吉凯基因公司，PowerLab数据分析处理系统购自美国AD Instruments公司，Masson三色染色试剂盒购自福州迈新生物科技开发公司，HE染色液购自徐州博立达生物技术有限公司。

1.2 动物与分组 60只17月龄的SHR购自北京维通利华公司，体重400～420 g，随机分为对照组、丹参酮组和丹参酮+miR-376b-5p组(n=20)，其中丹参酮组和丹参酮+miR-376b-5p组接受5 ml·kg-1·d-1的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液灌胃处理，连续12 w；此外，丹参酮+miR-376b-5p组尾静脉注射0.1 ml过表达miR-376b-5p的慢病毒载体，对照组接受5 ml·kg-1·d-1的生理盐水灌胃处理。所有大鼠均饲养于同一SPF环境中，自由摄食与饮水，饲养环境温度(23±2)℃，相对湿度45%～65%，光照与黑暗周期为12 h/12 h。

1.3 无创尾袖法测定血压 每组取8只大鼠，将大鼠置于配套固定器中，温水浸泡软化尾巴，采用PowerLab ML125/R无创尾动脉血压测定分析系统测定大鼠血压。重复3次，取均值。

1.4 血流动力学评价 12 w后对各组大鼠进行称重，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg后固定，行颈部正中切口，暴露气管后插管连接呼吸机维持呼吸(50次/min)，游离右侧颈总动脉并于其表面切一小口，将PE-50聚乙烯管(充满50 U/ml肝素生理盐水)向近心端插入并结扎固定，经PowerLab数据分析处理系统记录收缩压(SBP)和舒张压(DBP)，并对血压信号进行处理，记录平均动脉压(MAP)。进一步插管进入左心室内监测血流动力学指标，包括左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP) 和左心室压力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 心脏解剖学指标 待完成血流动力学评价后记录各组大鼠体质量，过量麻醉处死大鼠后，迅速开胸取出心脏组织，清洗后移除心房及右心室游离壁，称重左心室，同时根据公式计算左心室质量指数：左心室质量指数=左心室质量/体质量×100%。

1.6 心脏病理学指标 待实验结束后，每组取8只大鼠采用静脉注射过量的KCl使心脏收缩停止于舒张期，迅速开胸取出心脏组织，清洗后依次经4%中性甲醛固定、梯度酒精脱水及二甲苯透明后，适当修剪组织，取左心室中部冠状切面进行石蜡包埋，石蜡切片机制备5 μm切片，每个组织样本取5张切片分别进行HE染色以测量单个心肌细胞直径及Masson染色测量心肌间质和心肌血管周围胶原分布情况，最后计算心肌间质纤维化指数和心肌血管周围纤维化指数，共同评价心肌纤维化情况。

1.7 统计学处理 采用SPSS16.0软件，多组计量资料分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA检验)，两两比较采用SNK法。

2 结 果

2.1 3组大鼠的血压及心率比较 3组大鼠心率无显著差异(P>0.05)，丹参酮组的SBP、DBP及MAP均低于对照组(P<0.05)；与丹参酮组比较，丹参酮+miR-376b-5p组的SBP、DBP及MAP均升高，均无统计学差异(P<0.05)，而丹参酮+miR-376b-5p组以上指标与对照组(P>0.05)。见表1。

表1 3组大鼠的血压水平及血流动力学情况±s)

与对照组比较：1)P<0.05；与丹参酮组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 3组大鼠的血流动力学指标比较 丹参酮组的LVSP和LVEDP均低于对照组，dp/dtmax和-dp/dtmax均高于对照组(P<0.05)；与丹参酮组比较，丹参酮+miR-376b-5p组的LVSP和LVEDP均升高，dp/dtmax和-dp/dtmax水平降低(P<0.05)，且丹参酮+miR-376b-5p组以上指标与对照组均无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.3 3组大鼠的心脏解剖学指标比较 3组大鼠体质量无统计学差异(P>0.05)；丹参酮组的左心室质量及左心室质量指数均低于对照组(P<0.05)；与丹参酮组比较，丹参酮+miR-376b-5p组的左心室质量及左心室质量指数均升高(P<0.05)，且丹参酮+miR-376b-5p组以上指标与对照组均无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 3组大鼠的心脏解剖学指标比较±s)

2.4 3组大鼠的心脏病理学指标比较 丹参酮组的心肌细胞直径、心肌间质纤维化指数及心肌血管周围纤维化指数均低于对照组(P<0.05)；与丹参酮组比较，丹参酮+miR-376b-5p组的心肌细胞直径、心肌间质纤维化指数及心肌血管周围纤维化指数均升高(P<0.05)，且丹参酮+miR-376b-5p组以上指标与对照组均无统计学差异(P>0.05)。见表4。

表4 3组大鼠的心脏病理学指标比较±s)

3 讨 论

长期高血压会导致心室重构，主要表现为心肌细胞肥大及纤维化，后者可分为心肌间质纤维化和心肌血管纤维化〔2〕。心肌纤维化增加了心脏中非心肌细胞比例，严重影响心室功能，最终导致心力衰竭。丹参酮是传统中药丹参的心血管活性成分，具有改善微循环、抗氧化及抗炎等作用〔10〕。在老年高血压动物模型中的研究还证实丹参酮具有确切的抗心室重构作用〔11〕，但其具体机制尚不清楚。

miRNA是一类具有广泛调节作用的内源性RNA，能与靶基因的3'端非翻译区结合从而对靶mRNA进行调控。目前大量的miRNA被发现参与了心室重构的发生发展过程，如miR-133、miR-99a、miR-30及miR-34等〔5～7〕。Pan等〔8〕发现M3亚型乙酰胆碱受体可通过抑制miR-376b-5p发挥心肌保护作用。此外，通过miRNA靶基因预测软件TargetScan发现，胰岛素样生长因子结合蛋白-2、ryanodine受体2及脑源性神经营养因子均参与了心肌缺血的调控过程〔12，13〕。本研究表明丹参酮可改善心室重构。通过基因载体手段过表达miR-376b-5p，发现接受丹参酮处理后大鼠的心室重构指标无变化，直接证实过表达miR-376b-5p可消除丹参酮对老年SHR心室重构的改善效果，可能通过影响其靶基因表达逆转丹参酮的心血管保护作用。

此外，本研究发现miR-376b-5p对丹参酮改善老年SHR血压及血流动力学的作用亦有逆转效果，由于较高的基础血压和异常血流动力学状况可影响心室重构的进程，本研究推测miR-376b-5p可能通过影响血压及血流动力学参与对丹参酮作用的调控。

1 朱桂平,王 卓,林忠伟,等.MMP-9/TIMP-1在自发性高血压大鼠左室重构中的表达及血脂康胶囊的调控作用〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(11):2946-9.

2 魏 梅,刘永升,陈 洁,等.螺内酯联合美托洛尔对老年慢性心力衰竭患者左室重构及心功能的影响〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(6):1509-10.

3 冯 俊,李树生,梁黔生,等.丹参酮ⅡA对心力衰竭大鼠的心肌凋亡及miR-133水平的影响〔J〕.中国中西医结合杂志,2012;32(7):930-3.

4 赵智明,常文静,赵凌杰,等.丹参酮ⅡA 对压力负荷增加大鼠心室胶原重构的影响〔J〕.河北中医,2015;37(4):550-2,586.

5 Li Y,Cai X,Guan Y,etal.Adiponectin upregulates miR-133a in cardiac hypertrophy through AMPK activation and reduced ERK1/2 phosphorylation〔J〕.PLoS One,2016;11(2):e0148482.

6 Li Q,Xie J,Li R,etal.Overexpression of microRNA-99a attenuates heart remodelling and improves cardiac performance after myocardial infarction〔J〕.J Cell Mol Med,2014;18(5):919-28.

7 Bernardo BC,Gao XM,Winbanks CE,etal.Therapeutic inhibition of the miR-34 family attenuates pathological cardiac remodeling and improves heart function〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2012;109(43):17615-20.

8 Pan Z,Guo Y,Qi H,etal.M3 subtype of muscarinic acetylcholine receptor promotes cardioprotection via the suppression of miR-376b-5p〔J〕.PLoS One,2012;7(3):e32571.

9 Li LJ,Huang Q,Zhang N,etal.miR-376b-5p regulates angiogenesis in cerebral ischemia〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(1):527-35.

10 陈 姝,张 静,吴艳峰,等.丹参酮ⅡA磺酸钠的临床应用研究进展〔J〕.中国医药,2012;7(2):253-4.

11 冯 俊,陈华文,李树生,等.丹参酮ⅡA对慢性心力衰竭心肌重构的影响及其机制研究〔J〕.中国中医急症,2015;24(12):2069-71,2126.

12 Bazzoni F,Rossato M,Fabbri M,etal.Induction and regulatory function of miR-9 in human monocytes and neutrophils exposed to proinflammatory signals〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2009;106(13):5282-7.

13 Guo Z,Wang S,Jiao Q,etal.RNAi targeting ryanodine receptor 2 protects rat cardiomyocytes from injury caused by simulated ischemia-reperfusion〔J〕.Biomed Pharmacother,2010;64(3):184-90.

〔2015-12-19修回〕

(编辑 徐 杰)

陈 强(1980-)，男，主治医师，硕士，主要从事冠心病诊治研究。

R54

A

1005-9202(2016)22-5549-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.024