血清miR-96、miR-326在多发性硬化复发、缓解期表达水平的变化

叶励超 蔡若蔚 黄玉婷 林若庭 陈继兴

(福建医科大学附属第二医院神经内科，福建 泉州 362000)



血清miR-96、miR-326在多发性硬化复发、缓解期表达水平的变化

叶励超 蔡若蔚 黄玉婷1林若庭 陈继兴

(福建医科大学附属第二医院神经内科，福建 泉州 362000)

目的 探讨血清miR-96、miR-326表达水平与缓解-复发型多发性硬化(RRMS)的关系并评价其临床意义。方法 RRMS患者57例，其中复发期(急性期)组32例，缓解期组25例，正常对照组30例；用荧光定量PCR检测血清miR-96，miR-326相对表达量。结果 与RRMS复发期组和正常对照组比较，缓解期组血清miR-96相对表达量明显增高(P<0.001)；与RRMS缓解期组和正常对照组比较，复发期组血清miR-326相对表达量明显增高(P<0.001)。RRMS缓解期组血清miR-96相对表达量与扩大的残疾功能状态评分(EDSS)无相关性(r=0.22，P=0.30)，RRMS复发期组血清miR-326相对表达量与EDSS评分无相关性(r=-0.18，P=0.31)。结论 血清miR-96、miR-326与RRMS的炎症活动密切相关，可作为监测RRMS活动性的候选生物标记物。

多发性硬化；微小RNA；miR-96；miR-326

多发性硬化(MS)是一种自身免疫性疾病，以中枢神经系统白质受累为主，临床特点是病灶的空间多发性和时间多发性。复发缓解型(RR)是MS最常见的类型，以神经系统症状急性加重，伴完全或不完全缓解为特征。由于MS致病原因仍不清楚，临床表现多样及治疗反应不一，因此，各国学者都期待找出一种或几种可靠的生物学标志物，能够有助于监测 MS的病情进展及反映 MS 对于治疗的效果，但结果却不尽如人意〔1〕。微小RNA(miRNA)是一类长度21～25个核苷酸的非编码小分子组成的单链RNA，在转录后水平发挥重要的调节作用，参与人类生命活动及疾病进程的调控，例如细胞增殖、发育、分化、代谢、凋亡、血管生成、炎症和免疫〔2〕。miRNA表达和功能异常与癌症、神经变性和自身免疫疾病有关。在MS患者的病灶、血液、脑脊液及外周血单个核细胞中发现多种miRNA表达异常，提示其参与了MS的病理生理过程〔3～6〕。本研究通过检测RRMS患者复发期与缓解期血清miR-96与miR-326表达水平，探讨其与MS炎症活动的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年1月至2015年7月我院神经内科确诊RRMS 57例，排除合并肝肾疾病、肿瘤、糖尿病、急性感染、心脑血管疾病及其他自身免疫性疾病患者。RRMS诊断参照2010年修订的McDonald诊断标准〔7〕。RRMS复发期(急性期)组：32例，男9例，女23例；年龄21～60岁，平均(37.3±9.2)岁；病程10～98个月，平均(55.8±15.2)个月；扩大的残疾功能状态评分(EDSS)2.5～8.0分，平均(5.3±1.3)分。RRMS缓解期组：25例，男7例，女18例；年龄20～58岁，平均(38.4±7.9)岁；病程12～120个月，平均(60.4±18.6)个月；EDSS 1.0～7.0分，平均(3.1±1.2)分。正常对照组：健康体检者30例，男8例，女22例；年龄18～60岁，平均(38.5±8.7)岁。本研究通过医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法 两组患者皆于清晨空腹抽取肘静脉血2 ml，低温快速离心，30 min内分装200 μl血清于冻存管中，-80℃保存。

1.2.1 纯化miRNA和总RNA 将放于-80℃冰箱的血清样本200 μl，放在冰上，标本融化后加入3倍体积的 Trizol LS (Invitrogen，美国)震荡混匀，再加入0.5 ml氯仿震荡混匀，置于低温离心机，4℃以12 000 r/min 离心15 min，取上清，加入1.5 倍体积的无水乙醇，按照miRNeasy mini kit试剂盒(QIAGEN，德国)说明书步骤完成提取，获得的RNA溶解于200 μl无 RNase双蒸水中备用。

1.2.2 检测miRNA 使用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN，中国)分别进行miRNA逆转录和荧光定量PCR。反应体系为20 μl，包括第一链合成cDNA、miRcute miRNA premix及引物(应用Primer 5.0软件设计引物，引物序列见表1)。反应条件：94℃预变性2 min；然后94℃ 20 s、60℃ 35 s，进行35～45个循环反应。以miR-16作为内参。血清miR-96、miR-326 相对表达量计算公式为2-△△CT。每个样品测定3次取平均值，同时做空白组以提高实验可靠性。

1.3 统计学方法 使用SPSS10.0软件行Pearson检验。

表1 相关基因定量PCR 引物设计

2 结 果

2.1 3组血清miR-96、miR-326的相对表达水平比较 与RRMS复发期组和正常对照组比较，缓解期组血清miR-96相对表达量明显增高(P<0.001)。与RRMS缓解期组和正常对照组比较，复发期组血清miR-326相对表达量明显增高(P<0.001)，见表2。

2.2 血清miR-96、miR-326相对表达量与RRMS严重程度相关性 RRMS缓解期组血清miR-96相对表达量与EDSS评分无相关性(r=0.22，P=0.30)，RRMS复发期组血清miR-326相对表达量与EDSS评分无相关性(r=-0.18，P=0.31)，见图1和图2。

表2 3组血清miR-96、miR-326相对表达量

图1 RRMS缓解期组血清miR-96相对表达量与EDSS评分相关性

图2 RRMS复发期组血清miR-326相对表达量与EDSS评分相关性

3 讨 论

MS是一种免疫介导的中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘疾病，病因尚不明确，但CD4+T细胞在发病机制中扮演着至关重要的角色。表观遗传学研究发现miRNA表达异常与MS等自身免疫性疾病存在明确关联，MS发病过程中存在特异性miRNA 表达模式，miRNA通过影响巨噬细胞、T细胞和B细胞等免疫细胞的分化和激活调控免疫功能，这可能是导致MS发病的启动因素〔8～12〕。许多miRNA在血液、脑脊液等体液中存在一定的表达丰度且理化特性稳定，能够作为疾病的生物标志物，循环miRNA 也因此成为MS研究的热点〔13，14〕。国外学者通过检测RRMS患者外周血单个核细胞miRNA的表达水平，发现100多种miRNA明显表达异常，其中一部分是 MS 潜在生物学标志物〔15〕。

miR-96属于miR-183家族成员，定位于人类染色体7q32。本研究与Otaegui等〔16〕研究结果一致，该团队进一步利用基因处理工具寻找特异性miRNA 的靶基因及其可能参与的信号通路，结果发现miR-96调节的靶基因主要参与经典免疫相关通路(如白细胞介素信号通路、Ⅰ组代谢型谷氨酸受体通路等)和 Wnt信号通路的调控。在MS发病过程中，前者参与谷氨酸介导的毒性和中枢神经系统T细胞的激活，后者参与效应T细胞的发育和调节T细胞的活化。miR-96表达增加可以抑制相关靶基因转录后蛋白表达，从而干扰相关免疫通路，减轻MS炎症反应〔17〕。因此，血清miR-96有可能作为RRMS缓解期的一种潜在生物标记物。

高表达的 miRNA-326 可以抑制靶基因产物 Ets-1(一种调节Th17分化的负性因子)的表达，促进原始 CD4+T 细胞向 Th17 细胞的分化，加重 MS 患者病情。Du等〔18〕证实实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠外周血中Th17 细胞数目异常增高，并且与miRNA-326 表达水平呈正相关。RRMS复发期患者外周血淋巴细胞miRNA-326与miR-26a 表达水平明显升高，根据ROC曲线分析，miR-326有近100%的敏感性和特异性鉴别RRMS复发与缓解〔19〕。因此，血清miRNA-326表达水平可以反映RRMS复发期炎症活动情况。EDSS评分反映的是患者神经功能缺损程度和日常生活能力，而血清miR-96、miR-326表达水平间接反映MS炎症活动情况。但是Kacperska等〔14〕发现miR-92a表达水平与RRMS复发期患者EDSS评分存在负相关关系。综上，血清miR-96、miR-326与RRMS的炎症活动密切相关，可作为监测RRMS活动性的候选生物标记物。

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〔2015-03-18修回〕

(编辑 苑云杰)

福建省教育厅科技项目(No.JB13075);泉州市技术研究与开发项目(No.2015Z33)

叶励超(1973-)，男，硕士，副主任医师，主要从事神经免疫和脑血管病研究。

R774.6

A

1005-9202(2016)22-5519-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.011

1 检验科