巨大芽孢杆菌的应用研究进展

2016-12-17闫洪雪张鹏鹏梁文辉赵宏涛

北方农业学报 2016年4期

刘露，李丽，闫洪雪，张鹏鹏，梁文辉，赵宏涛

（1.海藻活性物质国家重点实验室，山东青岛 266400；2.青岛明月蓝海生物科技有限公司，山东青岛 266400）

巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium）属于芽孢杆菌属[1]，是一种好氧产芽孢的革兰氏阳性细菌，菌体直径大于 1.0 μm，俗称“大芽孢”菌[2]，是一种有益的土壤细菌，具有对环境友好、对粮食作物安全、对人畜无害等优点而受到了人们的普遍关注和深入研究。自1935年苏联学者蒙基娜从土壤中分离了一株具有解磷作用的巨大芽孢杆菌并投入生产开始[3]，对巨大芽孢杆菌应用的研究已有相当长的一段时间。20世纪50至60年代，为解决土壤中有效磷含量较低的问题，我国开始对巨大芽孢杆菌进行研究，并将其作为解磷菌用于微生物肥料的生产[4]。随着研究的深入，巨大芽孢杆菌的作用进一步被发掘，已经开始逐渐广泛地应用于解磷固氮、生物防治、畜牧养殖、水体净化、酶工程等方面[5-7]。本研究对巨大芽孢杆菌的解磷作用、生物防治作用、水体净化作用和表达外源蛋白作用进行了综述，为巨大芽孢杆菌的研究和应用提供参考。

1 巨大芽孢杆菌的解磷作用

磷是作物的必需营养元素之一，是土壤有效成分的重要组成部分。近些年来，为了提高作物产量和品质，人们不断向土壤中施用化学肥料和有机肥来供植物吸收利用，然而作物对当季肥料的利用率只有5%～10%[8]，大部分未被利用的磷积累在土壤中，与土壤中的成分发生反应，成为植物难以利用的形态，这种被固定在土壤中的磷很难被植物直接吸收利用，被称为无效态磷[9]，而可以被植物吸收利用的有效态磷仅占土壤全磷量的2%～3%[10]，而为了保障植物生长，人们继续使用化学肥料和有机肥来确保土壤中可利用的磷的含量，长此以往造成了大量不可再生资源的浪费，农产品品质下降，更为严重的是导致了土地资源利用不合理、土壤环境污染情况加重等问题。为解决这些问题，人们开始从其他方面寻求解决办法。科学研究表明，微生物对于土壤中的物质循环利用有着重要作用，磷素循环也不例外。国内外的一些研究证明，土壤中存在许多微生物，能够将固定在土壤中，植物难以吸收利用的无效态磷转化为有效态磷[11]，巨大芽孢杆菌便是这些微生物中的一种。

1.1 巨大芽孢杆菌的解磷效果验证

陈凯等[12]研究了巨大芽孢杆菌P1的解磷效果，巨大芽孢杆菌P1在蛋黄培养基上溶磷圈明显，具有解有机磷的作用。张维娜等[13]研究了巨大芽孢杆菌JD-2的溶磷效果，发现JD-2具有较强降解有机磷、无机磷的能力，发酵液接入土壤后，能达到比较好的解磷效果。研究解磷机理发现解磷作用是由菌株生长过程中的代谢产物决定的，代谢产物包括有机酸、质子和多糖等，其中有机酸[14]通过羟基和羧基对不溶性磷酸盐进行螯合使其溶解，质子[15]通过降低周围的pH来溶解不溶性磷酸盐，多糖[16]通过与有机酸的协同效应来推动不溶性磷酸盐的溶解。

1.2 巨大芽孢杆菌的发酵优化

关于提高巨大芽孢杆菌发酵活菌数的相关报道，李丽等[17]采用单因素试验和正交试验提高巨大芽孢杆菌M03发酵活菌数，菌数较初始培养基提高了8.08倍。王继雯等[18]研究了使巨大芽孢杆菌C2产芽孢的发酵配方，采用麸皮和豆粕为主要原料，即降低了生产成本又使芽孢形成率可达到100%，为菌株在复合生物肥料中的应用打下基础。饶犇等[19]应用Plackett-Burman设计法和响应面分析法（RSM）对影响芽孢数的配方进行了优化，发酵活芽孢数提高至42亿个/mL。

1.3 巨大芽孢杆菌在微生物肥料的应用

在农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心办理解磷菌登记证的菌种多为巨大芽孢杆菌，有巨大芽孢杆菌单独使用和与枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌等混合使用多种方式。产品形态有液体、粉剂和颗粒三种。目前正式登记巨大芽孢杆菌192种，临时登记36种。登记证中液体菌剂活菌数一般为2.0亿～5.0亿个/mL，粉剂和颗粒活菌数为0.2亿个/g、1亿个/g～2亿个/g。

1.4 巨大芽孢杆菌对农作物影响

巨大芽孢杆菌可以提高作物的产量。柳艳艳等[20]研究了不同浓度的巨大芽孢杆菌BM002微生物菌剂对油菜的促生作用，0.1 g/kg浓度对提高油菜产量和促进根系生产有显著作用。常慧萍等[21]从小麦根际分离了固氮菌、解磷菌和解钾菌并研究了相互间的作用，解磷菌能促进固氮菌和解钾菌的生长繁殖，3种菌混合使用可促进小麦的生长发育并提高产量。

2 巨大芽孢杆菌的其他应用研究

2.1 巨大芽孢杆菌的生物防治作用

芽孢杆菌是植物病害生物防治的主要生防细菌，在生长发育过程中产生拮抗性或竞争性的代谢产物，可抑制病原菌生长或杀死病原菌。最常用的生防芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。近年来关于巨大芽孢杆菌生防作用的研究较多，秦健[22]研究了巨大芽孢杆菌B196的抑菌作用，巨大芽孢杆菌B196可以抑制水稻纹枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病、番茄青枯病菌、烟草赤星病菌、烟草灰霉病菌、玉米白绢病菌和西瓜枯萎病菌等病原菌的生长。孔青[23]研究了海洋巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉的生长，并能抑制在花生上黄曲霉毒素的生物合成，其机理为通过竞争性生长和产生某种次级代谢产物，抑制黄曲霉的生长和黄曲霉毒素合成基因的表达。

巨大芽孢杆菌的生防作用应用到农业中，可以减少农药的使用，降低农资成本，并可以间接地降低农产品的农药残留，具有非常重要的意义。

2.2 巨大芽孢杆菌的水体净化作用

目前对巨大芽孢杆菌的研究逐渐从传统的菌种筛选、发酵条件优化和生理生化功能到特殊功能的研究，如巨大芽孢杆菌具有水体净化的作用。关于巨大芽孢杆菌的水体净化的研究主要集中在对水体有机物与磷的降解、修复水体富营养化以及在水产养殖中的应用。王琳等[7]采用投菌法对富营养化景观水体的试验研究，巨大芽孢杆菌对富营养化水体中的总氮（TN）、总磷（TP）和 CODcr均有一定的去除效果。侯颖等[24]从养鱼池水中分离筛选到一株具有氨氮降解作用的巨大芽孢杆菌，菌株在24 h内的氨氮降解率＞95%，并具有硝酸还原和亚硝酸还原能力，可作为益生菌应用到水产养殖中，有望解决养殖水体中的氨氮污染问题。利用巨大芽孢杆菌净化水体，可以避免利用化学制剂引起的二次污染问题，且成本较低，具有非常重要的意义。

2.3 巨大芽孢杆菌表达外源蛋白作用

与传统的大肠杆菌表达系统相比，巨大芽孢杆菌体积是大肠杆菌的100倍以上，巨大芽孢杆菌不产内毒素且蛋白分泌能力远远高于大肠杆菌；与其他芽孢杆菌表达系统相比，巨大芽孢杆菌不产生碱性蛋白酶，表达的外源蛋白不会被降解，且重组质粒在巨大芽孢杆菌中能稳定存在，不易丢失[25]，现已广泛应用于工业和学术研究。巨大芽孢杆菌具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌和发酵工艺成熟的优点。另外，巨大芽孢杆菌的细胞壁只含有肽聚糖和磷壁质，成分简单，在分泌的蛋白质产品中不会混杂有内毒素，且蛋白跨越细胞膜后，直接或加工后分泌到培养基中以活性结构存在而不发生聚集，不需要再对蛋白质进行复性[26]，因此巨大芽孢杆菌适用于工业大规模的蛋白质生产。

巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，其转化方法与革兰氏阴性细菌不同。一般有原生质体转化法和电击转化法。巨大芽孢杆菌的原生质体转化法是由PEG-6000介导的。巨大芽孢杆菌在溶菌酶的作用下转化为原生质体，构建好的携带外源基因的质粒转化进巨大芽孢杆菌中，原生质体转化法比较复杂。电击转化法简单快速且转化效率高，可有效地将DNA转入巨大芽孢杆菌中，是巨大芽孢杆菌最常用的转化方法。

2.4 巨大芽孢杆菌降解泡叶藻的作用

巨大芽孢杆菌除了具有解磷作用、生物防治作用、水体净化作用、和表达外源蛋白作用外，还有一些作用逐渐被发现。刘露等[27]筛选并鉴定了一株巨大芽孢杆菌2-2具有降解泡叶藻的作用，巨大芽孢杆菌2-2同时具有海藻胶裂解酶、蛋白酶和纤维素酶活性，将构成海藻的大分子物质降解成小分子、水溶性的物质，最大限度完整地保留了海藻中的生物活性物质和营养物质，有望取代传统的物理法和化学法，采用生物法进行海藻降解。

罗岩等[28]研究了巨大芽孢杆菌具有菌产亚硝酸还原酶的作用，并使菌株发酵产生的亚硝酸还原酶的活性由原始反应体系测得的221.015 U/mL增加至405.434 U/mL，巨大芽孢杆菌产亚硝酸还原酶可以降低腌制食品中亚硝酸盐含量，使亚硝酸盐的残留量控制在较低的水平，减少对人体的损坏。

2.5 巨大芽孢杆菌转化西罗莫司的作用

巨大芽孢杆菌具有转化的作用，近年来关于微生物转化的研究较多，微生物转化是对化合物进行结构修饰的一条有效途径，针对结构复杂的化合物，产生化学半合成难以获得的新化合物。黄捷等[29]以西罗莫司（又名雷帕霉素，具有免疫抑制、抗真菌、抗增殖和抗肿瘤的作用）为底物筛选出一株巨大芽孢杆菌，具有转化西罗莫司的作用，获得新的西罗莫司衍生物287-P1、287-P2和287-P3。其中，287-P1经结构鉴定为29，42-O-双去甲基雷帕霉素。

3 展望

磷作为植物生长所必需的元素，如何高效地利用土壤中的磷是今后研究重点，对发展可持续高效农业具有重要的战略意义。研究表明，无芽孢解磷细菌的解磷能力＞巨大芽孢杆菌＞蜡样芽孢杆菌，但是该菌不产芽孢，作为产品不易保存，可利用价值不高，综合考虑巨大芽孢杆菌更适合作为解磷菌来应用于微生物肥料生产。

目前微生物肥料所用菌多为单一菌株，无法同时解决多种问题，因此可以进一步探讨巨大芽孢杆菌和其他功能性菌株如根瘤菌、纤维素降解菌等的作用，采用混合菌种协同固定化技术[30]，研制复合微生物菌剂，达到充分利用土壤中各种营养物质、改善土壤环境、防治土传病害的目的。

虽然巨大芽孢杆菌拥有巨大的研究潜力，但芽孢菌的遗传稳定性差的缺点不容忽视，针对这些问题，可以通过转基因或者分子细胞杂交的方式筛选培养出高效，适应性强，比较稳定的菌株。还可以根据不同的土壤条件筛选驯化出适合特定土壤和作物的菌株。

通过近100年的研究，对巨大芽孢杆菌的研究比较成熟，除了在微生物肥料方面的应用以外，其他方面的应用也逐渐被发现。巨大芽孢杆菌不仅具有解磷作用，还具有生物防治作用、富营养水体净化作用和表达外源蛋白作用等，另外一些新的功能也逐渐被发现，可以更好地应用到农业生产、畜禽养殖、水体净化和生物制药等方面，并且巨大芽孢杆菌分布广泛，对环境友好，人畜无害。对巨大芽孢杆菌的研究具有非常重要的意义，应用前景广阔。

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