六味地黄汤及其“一补一泻”药对对肾阴虚模型小鼠HPT轴的影响

戴冰，杨梦琳，张嘉妮，李玉星，欧阳林旗，肖子曾*，邓桂明，杨磊

(1.湖南中医药大学附属第一医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)



实 验 研 究

六味地黄汤及其“一补一泻”药对对肾阴虚模型小鼠HPT轴的影响

戴冰1，杨梦琳2，张嘉妮1，李玉星1，欧阳林旗1，肖子曾2*，邓桂明1，杨磊1

(1.湖南中医药大学附属第一医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

目的：观察六味地黄汤及三个“一补一泻”药对对肾阴虚模型小鼠下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴的影响。方法：将小鼠随机分为空白组、模型组和给药组(六味地黄汤组、山茱萸-丹皮组、熟地-泽泻组、山药-茯苓组)共6个试验组；连续9天分别灌胃给予以上对应药物；第5～9天，除空白组灌胃蒸馏水外，其他各组按50 mg/kg每天灌胃氢化可的松注射液，制备小鼠肾阴虚模型，测定体质量，环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、甲状腺激素(TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)含量，观察甲状腺组织形态学改变。结果：肾阴虚模型小鼠体质量降低，血浆cAMP含量、血清TSH、T3、T4含量升高；六味地黄汤及其山茱萸-丹皮药对降低HPT轴中垂体分泌的TSH含量、下调肾上腺分泌的T3、T4含量，修复受损甲状腺组织。结论：六味地黄汤改善肾阴虚证的作用机制可能与降低HPT中垂体分泌的TSH、下调肾上腺分泌的T3、T4，修复受损甲状腺组织有关。其中山茱萸-丹皮药对是全方改善肾阴虚证的主要药效物质。

六味地黄汤；补泻药对；肾阴虚模型；下丘脑-垂体-甲状腺轴

六味地黄汤出自宋代医家钱乙《小儿药证直诀·卷下》， 由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮、茯苓组成，熟地、山茱萸、山药合用，补肾、肝、脾之不足即“三补”，泽泻、丹皮、茯苓合用，泻肾、肝、脾之有余即“三泻”；其中“一补一泻”药对：泽泻甘寒泄肾湿浊，与熟地合用，防其滋腻太过；丹皮辛苦清泄肝火与山茱萸合用，可制山茱萸之温涩；茯苓甘淡淡渗脾湿，与山药合用，助山药之健运，使该方具有滋补而不留邪，降泄而不伤正的滋补肾阴功效[1-3]。但目前对六味地黄汤作用机制及其配伍原理的研究多以整方及拆方“三补”“三泻”为主线开展，由于肾阴虚患者通常表现为神经内分泌调节系统中的HPT轴功能紊乱[4]，因此从HPT轴入手来探究整方及拆方“一补一泻”药对改善肾阴虚证的作用机制很有必要，这对揭示该方的配伍原理具有一定的科学意义。

1 试验材料与仪器

1.1 动物

清洁级昆明小鼠60只，雌雄各半，体质量(20±2)g，购自湖南斯莱克景达试验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2013-0004；饲养于湖南中医药大学试验动物中心。

1.2 药物

按六味地黄汤(熟地黄24 g，山茱萸12 g，山药12 g，牡丹皮9 g，泽泻9 g，茯苓9 g)称取原药材2剂，饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科。再按六味地黄汤中各药对的比例分别称取山茱萸-丹皮药对、熟地黄-泽泻药对、山药-茯苓药对，各2剂，各组药材均加6倍量水，浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min，合并2次药液后旋转蒸发仪浓缩，均得最终浓度为1.5 g/ml的浓缩液。

1.3 主要试剂

氢化可的松注射液(安阳九州药业有限责任公司，批号140820001A)；碘[125I]促甲状腺激素(TSH)放射免疫分析药盒(批号150820)、碘[125I]三碘甲状腺原氨酸(T3)放射免疫分析药盒(批号150820)、碘[125I]甲状腺素(T4)放射免疫分析药盒(批号150820)(北京北方生物技术研究所)；环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)酶联免疫分析试剂盒(R&D systems)。

1.4 主要仪器

RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；罗氏全自动生化仪(型号：Modular DPP)；小型冷冻离心机(型号：centrifuge 5415R)；Shandon325型石蜡切片机(英国 Shandon公司)；Motic B5显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司)。

2 试验方法

2.1 分组

取昆明小鼠60只，雌雄各半，适应性喂养7天后，随机分成空白组、模型组、六味地黄汤组、山茱萸-丹皮组、熟地-泽泻组、山药-茯苓组，每组10只小鼠。

2.2 给药

分组后第2天开始，连续9天，各组分别灌胃给予蒸馏水、蒸馏水、六味地黄汤药液9.75 g/(kg·d)、山茱萸-丹皮药液2.73 g/(kg·d)、熟地-泽泻药液4.29 g/(kg·d)、山药-茯苓药液2.73 g/(kg·d)；给药剂量按照人与小鼠等效剂量系数折算法算出。

2.3 造模

第6～9天除空白组灌胃蒸馏水外，其他各组均每天下午15:00灌胃氢化可的松注射液为50 mg/kg。

2.4 标本采集与处理

末次给药后禁食24 h，于试验第10天摘眼球采血，分离血清及血浆；取血后立即摘取甲状腺，放置于装有10%甲醛的冻存管中保存待测。

2.5 指标检测

2.5.1 症状观察、体质量测定

从试验开始，每日观察并记录小鼠症状，于造模前、后各测量小鼠体质量1次，并记录。将死亡小鼠剔除试验。

2.5.2 cAMP、cGMP含量测定

小鼠摘眼球采血(采血管中加入肝素钠)，血样放置30 min后，3500 r/min离心15 min，取上清按试剂盒说明进行检测。

2.5.3 TSH、T3、T4含量测定

小鼠摘眼球采血(普通采血管)，血样放置30 min后，3500 r/min离心15 min，取上清按试剂盒说明进行检测。

2.5.4 甲状腺组织形态学观察

各组小鼠甲状腺用10%甲醛固定，经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与贴片后，用苏木素-伊红(HE)染色后，常规显微镜下观察各组织形态结构的变化。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 对肾阴虚模型小鼠症状、体质量的影响

与空白组比较，模型组体质量有显著性差异(P<0.01)，并出现烦躁、易激惹、拱背扎堆、毛发枯槁易脱落、大便干结、饮食增多等症状，随着给药时间延长，上述症状逐渐加重。六味地黄汤组、山茱萸-丹皮组能减缓肾阴虚模型小鼠体质量下降的趋势，且能改善模型小鼠肾阴虚症状：小鼠表现较温顺、毛发有光泽、大便无干结，少拱背扎堆现象。熟地-泽泻组、山药-茯苓组不能减缓肾阴虚模型小鼠体质量下降的趋势，且不能改善模型小鼠肾阴虚症状：小鼠烦躁、易激惹、拱背扎堆、毛发枯槁、易脱落。结果见图1。

图1 六味地黄汤及其“补泻”药对对模型小鼠体质量的影响

3.2 对肾阴虚模型小鼠血浆cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影响

与空白组比较，模型组血浆cAMP含量、cGMP含量、cAMP/cGMP比值均有显著性差异(P<0.01)；与模型组比较，六味地黄丸组、山茱萸-丹皮组的血浆cAMP含量、cAMP/cGMP比值均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；六味地黄丸组血浆cGMP含量亦有显著性差异(P<0.05)，熟地-泽泻组、山药-茯苓组血浆cAMP含量、cGMP含量、cAMP/cGMP比值无显著性差异(P>0.05)。结果提示,六味地黄汤、山茱萸-丹皮药对能抑制肾阴虚模型小鼠血浆cAMP含量、cAMP/cGMP比值上升的趋势，六味地黄汤还能抑制血浆cGMP含量下降的趋势，使其血浆cAMP、cGMP含量，cAMP/cGMP比值基本恢复到正常水平。结果见表1。

3.3 对肾阴虚模型小鼠血清TSH、T3、T4含量的影响

与空白组比较，模型组血清TSH、T3、T4含量有显著性差异(P<0.01)；与模型组比较，六味地黄汤组、山茱萸-丹皮组血清TSH、T3、T4含量有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，熟地-泽泻组、山药-茯苓组血清TSH、T3、T4含量无显著性差异(P>0.05)。结果提示,六味地黄汤、山茱萸-丹皮药对能减缓肾阴虚模型小鼠血清TSH、T3、T4含量上升的趋势，且能使其血清TSH、T3、T4含量基本恢复到正常水平；熟地-泽泻药对、山药-茯苓药对不能减缓肾阴虚模型小鼠血清TSH、T3、T4含量上升的趋势。结果见表2。

表1 六味地黄汤及其“补泻”药对对模型小鼠cAMP、cGMP含量的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与六味地黄汤组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与山茱萸-丹皮组比较，%P<0.05，%%P<0.01。

表2 六味地黄汤及其“补泻”药对对模型小鼠TSH、T3、T4含量的影响

注：与空白组比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比，#P<0.05，##P<0.01；与六味地黄汤组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与山茱萸-丹皮组比较，%P<0.05，%%P<0.01。

3.4 对肾阴虚模型小鼠甲状腺组织形态学的影响

空白组甲状腺滤泡大小基本一致，呈圆形或椭圆形，内部充满红染胶质，胶质染色均匀，滤泡间无水肿，上皮细胞无增生。肾阴虚模型组甲状腺滤泡大小不一，少数滤泡胶质稀薄甚至缺失，滤泡壁上皮细胞明显增生；六味地黄汤组、山茱萸-丹皮组甲状腺滤泡大小正常，滤泡壁上皮细胞完整，内部充满红染胶质，胶质染色均匀，基本无稀薄或缺失。熟地-泽泻组、山药-茯苓组甲状腺滤泡上皮细胞有增生，大部分滤泡胶质稀薄，滤泡间有水肿。结果提示,肾阴虚模型小鼠甲状腺组织均受损，六味地黄汤、山茱萸-丹皮药对能修复肾阴虚模型小鼠受损甲状腺组织，熟地-泽泻药对、山药-茯苓药对不能修复肾阴虚模型小鼠受损甲状腺组织。结果见图2。

图2 六味地黄汤及其“补泻”药对对模型小鼠甲状腺组织形态学的影响

4 讨论

目前常用的肾阴虚模型造模方法有(促)肾上腺皮质激素法、甲状腺素法、甲状腺素联用利血平法、条件反射结扎肾动脉法、热性中药法等，其中(促)肾上腺皮质激素法是运用较早，应用最为广泛，且较为公认造模方法，本实验即采用该方法给予小鼠大剂量，短时间灌胃氢化可的松造模。考虑到中药起效较缓慢，而该实验造模时间又短，为了使药物有足够的时间发挥其疗效，本实验中除空白组与模型组外，其余各组小鼠均预防性给药。本研究发现,模型组小鼠出现体质量下降、烦躁、易激惹、拱背扎堆、毛发枯槁易脱落、大便干结、饮食增多等症状，且cAMP升高，与夏炳江[5]、王萍[6]等报道的肾阴虚模型表现基本一致，提示肾阴虚模型造模成功；而六味地黄汤、山茱萸-丹皮药对可改善肾阴虚证。

HPT轴由下丘脑、垂体与甲状腺组成的神经内分泌调节系统之一。该轴中TSH是由腺垂体合成分泌的一种直接调节甲状腺形态和功能的关键激素，它既能维持甲状腺滤泡细胞的生长发育，又能促进T3、T4的合成和分泌；甲状腺合成分泌T3、T4，这两种激素具有促进物质与能量代谢的作用。甲状腺功能主要受下丘脑与垂体的调节，下丘脑释放促甲状腺激素释放激素(TRH)，调节腺垂体分泌TSH，TSH进一步引起甲状腺激素的释放，血液甲状腺激素浓度变化通过负反馈调节下丘脑TRH和垂体TSH的分泌，构成HPT轴的自发性控制环路。现代研究表明，肾阴虚患者HPT轴中TSH、T3、T4水平升高[7]。故六味地黄汤改善肾阴虚证的作用机制之一可能与降低垂体分泌的TSH水平，甲状腺分泌的T3、T4水平，修复受损甲状腺组织有关。

本研究中山茱萸-丹皮药对改善肾阴虚证及其作用机制与六味地黄汤无差异，故山茱萸-丹皮药对可能是全方改善肾阴虚证的主要药效物质之一，但该药对中有哪些药效成分，它们是否通过HPT轴来改善肾阴虚证有待进一步研究。该实验还发现熟地-泽泻药对、山药-茯苓药对不能改善肾阴虚证；但它们与山茱萸-丹皮配伍后即全方改善肾阴虚证作用最佳，这充分体现六味地黄汤在方中运用“一补一泻”三对药对补泻并用，以补为主，以泻为辅，共同支撑方剂表达良好的滋阴补肾的配伍特色。

[1] 杨林,孙静,郝璐.六味地黄丸组方的临床应用及研究[J].浙江中医药大学学报,2010,34(5):796-798.

[2] 梁华，朱明雪，孙燕佩,等.六味地黄丸、金匮肾气丸的免疫调节作用研究进展[J].中医药学报，2012,40(2):97-99.

[3] 孙琳林，王书惠，卢林,等.左归丸与六味地黄丸对衰老大鼠抗氧化能力及海马区超微结构影响的比较研究[J].中医药学报，2012,40(3):140-143.

[4] 樊蔚虹,岳广欣,任小巧,等.肝肾阴虚证大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴的变化及中药对其调节作用[J].中国中医药信息杂志,2001,8(10):21-23.

[5] 夏炳江,童培建,孙燕,等.骨质疏松肾阴虚型小鼠病证结合模型建立的试验研究[J].中国中医急症,2013,22(7):1083-1086.

[6] 王萍,王喜军.肾阴虚证动物模型研究概况[J].中医药信息,2013,30(4):123-125.

[7] 陈维铭,钱涯邻,宋小平,等.天王补心丹对阴虚火旺型失眠患者下丘脑—垂体—甲状腺轴激素水平的影响[J].河北中医,2012,34(10):1454-1456.

湖南省教育厅重点项目(No.15A140)；康尔佳药业集团糖尿病研究所支持项目；湖南省自然科学基金项目(No.13JJ3096)

戴冰(1964-)，女，博士，教授，主要研究方向：临床中药学。

肖子曾*,教授，主要研究方向：方剂的应用及疗效机理研究。

2016-05-12

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0019-04

修回日期：2016-06-10