益气活血复方联合运动训练对慢性心衰大鼠GAP-43基因及蛋白表达的影响

马金,张艳

(1.辽宁医药职业学院,辽宁 沈阳 110101；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032)



益气活血复方联合运动训练对慢性心衰大鼠GAP-43基因及蛋白表达的影响

马金1,张艳2

(1.辽宁医药职业学院,辽宁 沈阳 110101；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032)

目的：观察益气活血复方联合运动训练对慢性心衰左室重构模型大鼠心肌组织中GAP-43 mRNA及蛋白差异表达，探讨益气活血复方联合运动训练减轻慢性心衰大鼠左室重构的机制。方法：选取普通级健康SD雄性大鼠，以冠脉结扎法配合力竭式游泳、减食等方法复制慢性心衰大鼠模型，随机将造模成功大鼠分为心衰模型组、益气活血中药组、运动训练组、益气活血复方联合运动训练组、西药组、西药联合运动训练组及假手术组，每组10只。分别给予药物治疗和(或)运动训练，治疗6周后处死取材。采用HE染色、光镜下观察各组大鼠心肌细胞的形态学变化；采用RT-PCR及Western-blot技术分别测定各组大鼠心肌组织中GAP-43基因及蛋白表达变化。结果：心衰模型组GAP-43 mRNA及蛋白表达均明显升高，与假手术组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；经药物和(或)运动训练干预后，与心衰模型组相比，各治疗组均明显下降(P<0.05)，但中药联合运动组效果最明显，运动组则最差，中药组与西药组效果基本相同。结论：益气活血复方联合运动训练降低模型大鼠心肌组织中GAP-43蛋白及基因表达，通过抑制缺血心肌神经元的代偿和修复机制从而减轻心室重构，这将为CHF的治疗方法的进一步探讨提供实验依据。

益气活血复方；运动训练；慢性心衰；生长相关蛋白-43

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure，CHF)是一种由于任何原因引起的心肌结构和功能的变化,导致心室充盈与射血障碍而引起的临床综合征[1]。其发病机制较为复杂，随着研究的不断深入，大多数学者普遍认为心室重构是其基本发病机制，并证实了多种神经内分泌因子参与了心室重构的过程[2-4]。GAP-43(Growth Associated Protein-43，GAP-43)作为一种轴突膜神经特异性蛋白质，参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生等过程，很有可能也参与心室重构。因此，本课题组针对CHF心室重构发病机制，选用益气活血复方联合运动训练作为治疗手段，从CHF模型大鼠心肌组织中GAP-43基因及蛋白的差异表达来进一步探讨益气活血复方联合运动训练减轻慢性心衰大鼠左室重构的机制，为CHF的治疗及康复提供科学依据和有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料

益气活血复方(黄芪、人参、红花、丹参、益母草、三七粉、葶苈子)，按照相对密度为1.05～1.08进行煎煮、浓缩成汤液。赖诺普利片(上海信谊万象药业股份提供，每片10 mg，国药准字：H10960265)。以上所有药物均购自于辽宁中医药大学附属医院药剂科。

1.2 方法

1.2.1 慢性心衰大鼠模型塑造

3月龄健康SD大鼠(普通级)70只，雄性，体质量200～230 g，购买于辽宁中医药大学动物实验中心，适应性喂养1周。采用冠脉结扎，配合力竭式游泳、减食等方法复制CHF大鼠模型。大鼠腹腔麻醉，经喉气管插管术连接小动物呼吸机，频率50～55次/min，潮气量0.6～0.9 ml，描记正常心电图(图1)。行开胸手术，于左冠状动脉前降支起源点1～5 mm处用结扎左冠状动脉主干，心电示波器显示ST段及T波有明显异常改变(图2)，缝合并处青霉素钠敷伤口，康复后将其饲料减半，同时每天游泳至其疲乏，每日1次，4周后多普勒超声心动图检测(图3、图4)，以左室射血分数小于60%作为心衰模型成功的标志,同时大鼠出现体质量减轻，精神萎靡，毛色无光泽等表现，列入观察对象。

图1 大鼠行冠脉结扎术前心电图

图2 大鼠行冠脉结扎术后心电图

图4 4周后造模成功大鼠超声心动图

将造模成功的60只大鼠，随机分成6组，每组10只，分别为：心衰模型组、益气活血中药组、运动训练组、益气活血中药联合运动训练组、西药组、西药联合运动训练组，余下10只大鼠为假手术组。除心衰模型组、假手术组予常规等容积生理盐水灌胃外，其余各组于造模成功后给予药物治疗。各给药组大鼠运动训练于造模成功后1周进行。每次50 min，6周超声心动图检测后，麻醉处死，摘取心脏组织-80℃保存待测。

1.2.2 HE染色，光镜下观察心肌形态学变化

将制备好的标本在10%福尔马林中固定；梯度酒精脱水；中性树胶封固，加盖玻片封固后，在显微镜下观察。

1.2.3 RT-PCR法检测大鼠心肌组织中GAP-43 mRNA表达

参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA；紫外光分光光度计测定并计算总RNA浓度和纯度；逆转录合成cDNA；反转录后以cDNA 为模板进行PCR扩增。GAP-43引物为：上游5′-AGGAAAGGAGAGAAGGCAGG-3′，下游为:5′-GCAGGAGAGACAGGGTTCAG-3′,扩增长度为778 bp；内参GAPDH引物序列为：上游5'-GCAAGTTCAACGGCACA-3'下游5'-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3'，扩增长度为201 bp。扩增条件为：95℃，5 min→95℃，45 s；60℃，34 s；95℃，45 s(35个循环)→60℃，1 min。然后按照取上述产物4 μl 与上样缓冲液1 μl混匀，进行5%琼脂糖凝胶电泳，电压80 V， 45 min后取下凝胶，Gel-Pro AnalyzerVersion3.0软件进行结果分析。

1.2.4 Western-blot法检测各组大鼠心肌组织中GAP-43蛋白表达

蛋白裂解液提取大鼠心肌组织中GAP-43的总蛋白；96孔酶标板法对蛋白定量，绘制标准曲线，并计算待测样品浓度及上样量；根据分离蛋白质的分子量，室温下配制凝胶；待聚合后，电压150 V下行10%SDS-PAGE凝胶电泳分离；采用半干式转膜法进行蛋白转移；1∶1000稀释一抗，1∶2000稀释二抗；ECL法在暗室中进行X光胶片曝光；凝胶成像分析、记录蛋白电泳带灰度值，并进行定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠心肌细胞的形态学变化

经HE染色后，在40倍光镜下观察各组大鼠心肌细胞的形态学变化。结果发现假手术组大鼠心肌细胞排列规整，横纹清晰，大小、形态正常，肌纤维未见空白、断裂及缺损区；心衰模型组则见心肌细胞相互交织，核固缩，出现部分空白区，异染色质呈现团块状，相邻细胞闰盘间隙明显增宽，粒粒连接及紧密连接消失，肌原纤维排列紊乱、断裂及缺失；经中药、运动及西药干预各组大鼠心肌组织结构均呈心肌细胞排列比较有序，形态结构基本一致，肌纤维排列较规整，有部分断裂及缺损，偶有空白区等情况，但以中药联合运动组大鼠心肌细胞组织形态基本正常(见图5)。

图5 HE染色各组慢性心衰大鼠心肌组织形态特征

2.2 RT-PCR法检测各组大鼠心肌组织中GAP-43 mRNA表达情况

在Marker DL 778 bp处和201 bp处分别为GAP-43和GAPDH的扩增带。取两者的比值为基因表达量。结果显示,心衰模型组GAP-43 mRNA表达明显升高，与假手术组有统计学意义(P<0.05)；经药物和(或)运动训练干预后各治疗组GAP-43 mRNA明显下降，与心衰模型组相比，均有显著性差异(P<0.05)，但中药联合运动组效果最明显，运动组则最差，中药组与西药组效果基本相同(见表1、图6)。

表1 各组大鼠心肌组织中GAP-43 mRNA表达水平

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

图6 各组大鼠心肌中GAP-43 mRNA表达凝胶示意图注：1.心衰模型组；2.假手术组；3.中药组；4.中药配合运动组；5.西药组运动组；6.西药配合运动组；7.运动组。

2.3 Western-blot法检测各组大鼠心肌组织中GAP-43蛋白表达情况

与假手术组对比，心衰模型组GAP-43蛋白表达明显升高(P<0.05)；经药物和(或)运动训练干预后各治疗组GAP-43蛋白表达量明显下降，但均未达到正常水平，与心衰模型组相比，均有显著性差异(P<0.05)，但中药联合运动组效果最明显，运动组则最差，中药组与西药组效果基本相同。见表2、图7。

表2 各组大鼠心肌组织中GAP-43蛋白表达水平

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

图7 各组大鼠心肌组织中GAP-43蛋白表达示意图

3 讨论

慢性心衰(CHF)作为临床多种心血管疾病的终末期表现，因其致残率高，死亡率高，治疗棘手，对于CHF病理机制的研究及有效治疗方法的探求，一直是国内外医学界长期探讨的热点问题之一[5-10]。随着对心衰发病机制认识的深入，发现心室重构是心衰发生的基本机制，并认识到心衰的恶化是由于多种神经内分泌因子参与了心室重构的过程。心衰时，机体激活内源性神经内分泌系统而改变血流动力学异常，并直接作用于心肌细胞，而心脏作为交感神经的“司令部”，通过释放去甲肾上腺素到突触间隙中，通过再摄取对心脏发挥正性变时、变力、变传到作用[11]。在压力超负荷状态下，机体将平衡减少NE存储量，诱导心脏交感神经密度增高，活性失调，对心脏功能降低代偿反应；另一方面，TH表达增多，心肌纤维化并伴随Ⅰ,Ⅲ型胶原高释放且排列紊乱。由此，临床上对于心衰的治疗模式也从传统的“强心、利尿、扩血管”的模式转变为“阻滞神经体液因子和细胞因子的激活”，并不断研发和改良了血管紧张素转换酶抑制剂、AngⅡ受体阻滞剂等抑制和延缓心室重构药物，临床疗效显著。

而GAP-43作为一种胞膜磷酸蛋白质，其主要调控着生长锥的形成、附着、延伸和抵抗回缩，是轴突生长及调节的关键调控蛋白，它在组织中存在量的多少直接决定该部分神经发育、轴突再生、突触重建等生物活动的发生，在国际上，已将其做为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子探针[12-13]。近年来，随着研究的深入，大量文献证实心肌在缺氧缺血状态下， GAP-43 的异常表达将增加心肌交感神经的分布和密度而致使心肌细胞及组织重塑[14]。本课题组根据中医“虚则补之”理论，选用人参与黄芪的经典益气温阳配伍，合理搭配药物，自成益气活血复方，并应用于临床治疗，疗效显著。同时对该方药进行了大量的动物实验与临床疗效观察，研究结果均显示其既可以强心、利尿、扩血管以治标，又可以抑制神经内分泌过度激活，减少心室重构以治本，能降低大鼠血浆及局部的PRA(肾素活性)、AngⅡ水平，以抑制RAS的激活；能改善心衰大鼠的症状和心肌细胞变化，能降低TXB2(血栓素B2)，PAI-I、TGF-β水平等，为防治CHF提供了有力的科学依据[15]。

由此，笔者大胆推测，GAP-43很有可能是参与并调控心室重构的关键蛋白。并在益气活血复方基础上配合运动训练对多个实验组进行对比观察，采用HE染色、RT-PCR及Western-blot实验手段，从组织、基因和蛋白水平共同观察益气活血复方联合运动训练对慢性心衰心室重构的干预作用及其与GAP-43的关系机制，为慢性心衰的机制研究及慢性心衰的康复治疗提供科学依据和有效方法。

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辽宁省教育厅基金资助项目(No.L2012498)

马金(1976-)，女，副教授，博士，主要研究方向：康复医学。

2016-01-12

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0035-04

修回日期：2016-02-10